實驗用生物樣品的嚙齒類微生物污染的檢測管理

龐萬勇，賀爭鳴

（1.賽諾菲研發中心藥物安全評價和動物實驗部，北京 100022； 2.中國國家食品藥品檢定院實驗動物管理處，北京 100050）

生物樣品廣泛應用于實驗研究和檢測，這些生物樣品包括所有來源于動物的或經由動物傳代的細胞、寄生蟲、腫瘤株/組織、病毒株、鼠血清等。這些生物樣品可能攜帶/污染有人和/或動物的傳染性病原，而且多為來源未知或不詳。某些生物樣品的來源可能很潔凈無污染，但它們可能在采集時、在液氮罐中保存時、或在操作或處理過程中（如用處理過嚙齒類動物血清的柱進行純化時）被污染。這些被污染的生物樣品在用于實驗研究前應該進行檢測，因為它們可能會造成整個實驗動物種群的污染甚或淘汰，并且對實驗造成不可估量的損失。需要進行檢測的生物樣品包括（但不局限于）細胞系（原代細胞、傳代細胞、腫瘤細胞和腫瘤細胞系）、細胞系的產品（如基底膜基質蛋白）、飼養細胞（如脾細胞和胸腺細胞等）、腹水、純化的抗體或其它蛋白。本文擬對常規的微生物檢測的項目作一綜述，并簡要地介紹各病原對科學研究、職業健康安全或動物種群生物安全的影響。

傳統的檢測方法是小鼠/大鼠/倉鼠抗體產生試驗，即將待檢生物樣品接種到小鼠/大鼠/倉鼠體內，然后檢測是否有相應的抗體產生，進而來反推生物樣品中是否污染有特定的病原。其優點是只有在生物樣品中含有足夠量的能感染動物的活的病原體時（即接種的生物樣品中含有不低于最低感染劑量的病原），該試驗才會是陽性，即才會有抗體產生。該類試驗常在GMP設施中應用。其缺點是比聚合酶鏈式反應（PCR）方法慢，而且該方法的有效性是基于一個假設（尤其是應用于GMP時），即如果在被檢樣品中的病毒或病原體是滅活的，那么在整批樣品/產品中的病原都是滅活的。

現在多用的檢測方法是PCR方法。PCR方法的優點是很靈敏（可檢測出1～2個拷貝的病原基因序列）、快速而且無需使用動物，但其缺點是PCR的陽性結果不一定代表樣品污染有感染性的病原（即活的病原）。待檢樣品的量通常很小，就算污染有活的病原體，病原體在待檢樣品中也不一定能達到最低感染劑量，因此抗體生成試驗可能為陰性，所以用PCR比較保險。要注意的是在檢測過程中要使用陰、陽性對照，以及樣品中是否有抑制性成分，并考慮到核酸提取的質量控制。

理論上講，每個實驗動物設施應該監測對動物種群和實驗研究（以及對人類健康和環境等）造成負面影響的病原體，尤其是那些能造成嚴重的臨床疾病、和/或改變被感染細胞的功能進而誘發機體防御機制（如免疫系統）改變的病毒。研究機構應該根據自身的實際情況（科研項目的性質、本單位的和或第三方的檢測機構的檢測能力等），結合現行的國家標準來制訂適宜的且可行的檢測指標。常見的鼠源微生物檢測項目（摘自 http：//www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_d_rodent_ viral_PCR_for_research_biologics.pdf）舉例如下表所示：

病原小鼠重要病原 大鼠重要病原 “全面”檢測鼠諾瓦克病毒Murine Norovirus √ √小鼠細小病毒Mouse parvoviruses（MPV-1，MPV-2，MPV-3，MPV-4，MVM）√ √小鼠肝炎病毒Mouse hepatitis virus √ √小鼠輪狀病毒Mouse rotavirus（MRV/EDIM）√ √鼠痘病毒Mouse pox（Ectromelia）√ √多瘤病毒Polyoma virus √ √小鼠腺病毒Mouse adenovirus（MAV-1，MAV-2）√ √漢坦病毒Hantavirus hantaan √ √漢坦病毒漢城株Hantavirus Seoul √ √呼腸孤病毒Reovirus（Type 1，3）√ √ √淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒Lymphocytic choriomeningitis virus √ √ √乳酸脫氫酶增高癥病毒Lactate dehydrogenase-elevating virus √ √ √小鼠腦脊髓炎病毒Theiler＇smurine encephalomyelitis virus（TMEV［GD-7］）√ √ √仙臺病毒Sendai virus √ √ √支原體屬Mycop lasma √ √ √肺炎支原體Mycoplasma pulmonis √ √ √大鼠巨細胞病毒Rat cytomegaloviurs √ √大鼠腦脊髓炎病毒Rat theilovirus √ √大鼠細小病毒Rat parvoviruses（RPV，KRV，RMV，H-1）√ √大鼠輪狀病毒Rat rotavirus √ √大鼠冠狀病毒Rat coronavirus √ √K病毒K virus √小鼠巨細胞病毒Mouse cytomegalovirus √小鼠胸腺病毒Mouse thymic virus √小鼠肺炎病毒Pneumonia virus ofmice √

對選取上述病原體進行檢測的理由，即這些微生物對動物健康、種群的生物安全以及對實驗或檢測的影響簡明地綜述如下。

鼠諾瓦克病毒：鼠諾瓦克病毒（MNV）屬于杯狀病毒科，是一種小的無囊膜的單鏈RNA病毒。大約有90％的人類病毒性胃腸炎與該病毒有關。某實驗室在進行人的樣品（接種到 RAG2-/-，STAT1 -/-小鼠體腔）的檢測時，從死亡的小鼠分離到了MNV-1。MNV-1是首個在細胞上成功培養的MNV病毒。MNV在小鼠的流行率超過30％（是其它小鼠病毒的10倍）。在免疫健全的小鼠不引起臨床癥狀，但可在其小腸、脾臟、腸系膜淋巴結和肝臟檢測到病毒核酸。研究揭示該病毒對巨噬細胞和樹突狀細胞有親嗜性，并且感染為持續性的，所以感染的小鼠不易用于免疫學（特別是與巨噬細胞源性細胞相關的）研究。在免疫缺陷小鼠，依品系/免疫缺陷以及接種途徑等的不同，可引起肝炎、間質性肺炎、腦炎等，因此不適于用于研究。

小鼠細小病毒：小鼠的細小病毒主要有兩種即小鼠微小病毒（mouse m inute virus，MMV或 MVM）和小鼠細小病毒1（mouse parvovirus，MPV）。小鼠細小病毒是當代實驗小鼠種群中流行最廣泛的病毒之一。MVM是移植腫瘤最常見的污染物之一，因此MVM可通過被污染的腫瘤細胞而進入并污染實驗動物設施。另外，MVM可引起腫瘤細胞溶解并有免疫抑制作用。MPV可引起感染小鼠的持續性感染和免疫紊亂。小鼠細小病毒的防控依賴于嚴格的屏障設施管理、隔離檢疫、健康檢測，并對計劃引入并用于動物的生物樣品進行檢測。

小鼠肝炎病毒：小鼠肝炎病毒為大的、多形態的、有囊膜的RNA病毒，屬于冠狀病毒。其多嗜性、廣泛分布和傳染性使其最有可能影響到小鼠的生物學反應并污染移植腫瘤和細胞系等。感染免疫缺陷小鼠或污染來自免疫缺陷小鼠的腫瘤都會對研究造成破壞性的影響。該病毒感染淋巴組織，因而對免疫系統產生重大而持久的影響，可刺激或抑制免疫反應。合并感染該病毒可改變其它病毒、細菌、寄生蟲的感染過程，使感染加重。小鼠肝炎病毒可改變肝臟酶活性、降低肝臟部分切除后的再生、引起貧血、白細胞減少癥和血小板減少，并降低某些易感品系小鼠的糖尿病發生率。

小鼠輪狀病毒：小鼠輪狀病毒感染影響腸道吸收和酶的濃度，可引起腹瀉和生長遲緩，影響到使用年輕動物的研究。一過性的胸腺細胞壞死可影響到免疫反應。另外，B細胞缺陷的小鼠感染后可持續排毒。

鼠痘病毒：鼠痘病毒具有多器官親嗜性并且經常為亞臨床活動性感染，使其極易污染小鼠組織和生物樣品，并成為其傳播到別的小鼠或小鼠種群的一個主要途徑。易感動物近乎100％的死亡率對研究和實驗動物設施都具有極大破壞性。

多瘤病毒：多瘤病毒的多嗜性使其易污染移植性腫瘤和細胞系，進而污染動物種群。成年無免疫缺陷小鼠自然感染多瘤病毒，對研究可能沒有影響。沒有多瘤病毒的種群的新生鼠感染該病毒可引起廣泛分布的腫瘤，進而干擾實驗和使動物壽命縮短。

小鼠腺病毒：小鼠腺病毒不大可能影響使用免疫健全小鼠的研究，但據報道MAdV-1可增加感染小鼠對大腸桿菌性腎盂腎炎的易感性。MAdV-1可被用作實驗工具（如用作基因工程載體），因而有可能造成小鼠種群的“醫源性”污染。MAdV-2更常見但基本無害，甚至于對幼鼠和免疫缺陷鼠也相對不致病。

漢坦病毒：漢坦病毒對研究的影響主要是因為它是嚙齒類重要的人畜共患病病原，可能引起人類嚴重的感染。漢坦病毒在亞洲（日本）和歐洲（比利時和英國）引起過好幾起和實驗室感染相關的人類出血熱和腎綜合征（HFRS）。這些感染可追溯到感染的實驗大鼠、野鼠和試驗感染的鼠。該病毒廣泛分布于北美的野鼠群中，因此必須時刻保持警惕。

呼腸孤病毒：繁育種群中對呼腸孤病毒沒有免疫力的母鼠所產哺乳小鼠感染該病毒后死亡率很高。從移植性腫瘤中?？煞蛛x到該病毒。該病毒可能具有腫瘤溶解性，并可影響涉及肝臟、胰腺、心血管或神經系統的研究。

淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒：淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒是一種重要的人畜共患病病原，這也是該病毒對研究最重要的影響，尤其是涉及到實驗倉鼠或免疫缺陷小鼠的感染時危險性更高。該病毒具有多器官親嗜性并且宿主眾多，因此常易污染移植性腫瘤、細胞培養、病毒（如白血病病毒、狂犬病毒、小鼠肺炎病毒等）和弓形體，進而污染別的動物設施。該病毒對免疫有刺激或抑制作用。小鼠感染該病毒可抑制由多瘤病毒和乳腺腫瘤病毒所引起的腫瘤，并干擾小鼠和豚鼠的移植性白血病。感染該病毒可抑制細胞免疫，可延遲對皮膚移植物和移植性腫瘤的排斥。感染還可增加小鼠對鼠痘病毒和細菌內毒素的敏感性。

乳酸脫氫酶增高癥病毒：乳酸脫氫酶增高癥病毒仍然是移植性腫瘤包括雜交瘤最常見的微生物污染之一。該病毒感染一般不引起臨床疾病但可顯著地改變巨噬細胞的功能和免疫反應（如一過性胸腺壞死、淋巴細胞減少、細胞免疫抑制、細胞因子活性增高、體液免疫改變、增強或抑制腫瘤生長、對其它病原的免疫力改變、高 γ免疫球蛋白血癥、減少自身抗體的形成等），使得被感染的小鼠不能用于免疫學研究。另外，某些品系的動物感染該病毒可引起腎小球腎炎和/或中樞神經系統疾病。

小鼠腦脊髓炎病毒：小鼠腦脊髓炎病毒一直是用于接種小鼠的臨床樣本包括小鼠血清在內的一種污染物。大多數自然感染的小鼠沒有臨床癥狀，但個別的強毒株可引起致死性腦炎，并伴有一過性病毒血癥。該病毒可影響中樞神經系統、免疫系統和肌肉骨骼系統的研究。有關大鼠的腦脊髓炎病毒對研究的影響尚無報道，但應該可以視為與小鼠腦脊髓炎病毒相似。

仙臺病毒：仙臺病毒可以在易感的和免疫缺陷的小鼠引起明顯的疾病甚至死亡，使小鼠對細菌性呼吸系統疾病易感性增強，影響免疫反應，并使創傷愈合延緩。雖然未曾有過垂直傳播的報道，但胎兒吸收、妊娠延長和胎兒死亡可能與母鼠感染該病毒有關聯。該病毒的感染可抑制移植性腫瘤的生長（可能與病毒引起的腫瘤細胞膜的改變有關）。

支原體：肺炎支原體可污染細胞培養，可經由被污染細胞及其產物的注射而傳播感染。肺炎支原體可影響到很多的實驗研究，感染的小鼠不宜用于研究。該病原可引起臨床疾病，隱性感染的鼠可因其它呼吸道病毒如仙臺病毒、小鼠肝炎病毒等的介入而出現下呼吸道疾病的暴發。肺臟是主要的靶器官（表現如纖毛功能降低、呼吸道神經支配錯亂、內皮細胞形態和功能改變等）但該病原也可在動物體內散布而侵害多個器官系統。肺炎支原體感染可抑制體液和細胞免疫，使動物對其它疾病易感。感染的動物遲發型變態反應減弱、T細胞亞類改變、淋巴細胞和嗜中性粒細胞數量增多。肺炎支原體感染能影響腫瘤轉移實驗。而且肺炎支原體感染的動物不能用于其它的支原體的研究。

大鼠巨細胞病毒：大鼠巨細胞病毒與小鼠巨細胞病毒的抗原性不同。該病原常見于野生大鼠（基于唾液腺的病變而做出的診斷）但不存在于實驗大鼠種群。該病毒主要侵害唾液腺和淚腺，引起特異性的“巨細胞”和非化膿性間質性炎癥。哺乳鼠腦內接種可引起非化膿性腦炎。據文獻記載，該病毒可引起巨噬細胞功能改變、一過性的體液免疫抑制、在器官移植實驗中引發（該病毒的）感染、并可加重膠原蛋白誘導的關節炎等。

大鼠細小病毒：大鼠細小病毒的致病株感染可引起疾病和死亡，但其感染最可能影響到依賴于細胞增殖的那些生物學反應。大鼠病毒（RV）具有親淋巴細胞性，因而可引起免疫反應的改變，例如 T細胞對移植性腫瘤的應答、在對糖尿病不易感的大鼠品系（通過擾亂Th1樣T細胞應答）引發自身免疫性糖尿病、減弱淋巴細胞混合培養中針對同種異型抗原的增生和細胞溶解性反應等。另外，大鼠的細小病毒具有親瘤性，可干擾腫瘤動力學。如果細胞培養或其它生物樣品污染該病毒可引起細胞病變或病毒傳播。

大鼠輪狀病毒：大鼠輪狀病毒是幼年大鼠傳染性腹瀉的病原，屬于B組輪狀病毒。該病毒在形態學上與以前發現的輪狀病毒株相似但具有不同的抗原性，可能來源于人類。哺乳大鼠接種人的輪狀病毒分離株后產生和幼年大鼠傳染性腹瀉一致的腹瀉性疾病。大鼠輪狀病毒對研究的影響有兩個方面，一是該病毒可能來源于人（人畜共患病?），二是造成幼年大鼠的腹瀉和一過性生長遲緩。

大鼠冠狀病毒：大鼠冠狀病毒感染可影響到呼吸系統、唾液腺、淚腺、免疫系統和眼科學的研究。可影響到上述器官、系統的功能和形態學。感染急性期的大鼠唾液腺增大并且呼吸道分泌物增多可妨礙正常呼吸，所以在吸入麻醉過程中?？沙霈F意外死亡。部分大鼠會因淚腺炎和哈德氏腺的功能受損而出現永久性的眼損傷，這個問題常會影響到眼科學研究和長期毒性試驗研究。該病毒可加重大鼠的肺炎支原體或纖毛相關呼吸道桿菌的感染。該病毒還能改變大鼠的采食行為、引起繁殖異常（發情周期異常以及新生鼠死亡）、抑制肺巨噬細胞的吞噬和白介素-1的產生、增強B型流感嗜血桿菌在鼻內定植、損耗唾液腺上皮生長因子、加重同種骨髓移植大鼠的移植物排斥宿主疾病等。因為上皮生長因子對繁殖和腫瘤發生有影響，所以對這兩方面的研究也可能有影響。胸腺缺如的大鼠對該病毒尤其易感。

K病毒：K病毒在實驗小鼠群中很少見或不存在，所以其影響有限，但是對實驗感染的成年裸小鼠還是致病的。

小鼠巨細胞病毒：自然感染小鼠巨細胞病毒的小鼠很少發生明顯的疾病。但是該病毒有一系列的免疫抑制作用，涉及到B細胞、T細胞、巨噬細胞和干擾素等。持續性感染可導致免疫復合物性腎小球腎炎和抗核抗體。該病毒與條件性致病菌如綠膿桿菌有協同作用，可加重其所致疾病。

小鼠胸腺病毒：小鼠胸腺病毒對新生小鼠的T細胞有破壞性作用，因而可對細胞免疫和體液免疫產生短期或長期的抑制。另外，由唾液腺制備小鼠巨細胞病毒種子可污染該病毒。

小鼠肺炎病毒：小鼠肺炎病毒對免疫缺陷小鼠有影響，但在自然情況下對其它小鼠并無重大影響。可在實驗大鼠和小鼠發生種間傳播。該病毒可加重卡氏肺孢子蟲的侵染。

隨著科學技術進步和實驗動物的產業化，實驗動物的微生物學質量取得了很大的提高并得以保持。但事實上我們現在所擔憂的那些實驗動物疾病大多都是在過去的15～20年間發現的。一個科研或實驗機構在制訂生物樣品微生物學污染檢測的方案時，尤其是在選定對哪些微生物進行檢測時，應該首先考慮到所要從事的科研內容和實驗時間長短、實驗設施中飼養的實驗動物品系和免疫學狀況、某一特定研究要使用的實驗動物品系和免疫學狀況、生物樣品的性質和來源等。其次要去查閱相關的實驗動物醫學參考資料（學習、了解哪些微生物或病原體可能會和本研究有關、是否有成熟的檢測方法等）和/或咨詢相關的專家，初步選定需要或最好要檢測的微生物。再其次要考慮單位內部的微生物學檢測機構是否能進行相關的檢測。再次要看是否有第三方的實驗室可以檢測單位內部不能檢測的那些微生物，以及價格、出報告時間等。然后應該查詢相關資料，找出如果有檢測出現陽性結果，是否可以凈化、如何凈化，如果不能凈化實驗可不可以做，做的話負面影響有多大，從而在對實驗結果作分析時做到心中有數。應考慮采取防范措施以將污染對科研、動物種群生物安全等的影響降到最低。

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