雌呋栓微生物限度檢查方法的建立

何培孝 王偉娜 楊利紅

雌呋栓微生物限度檢查方法的建立

何培孝 王偉娜 楊利紅

目的建立雌呋栓的微生物限度檢查方法。方法 按照《中國藥典》2010年版附錄的要求進行方法學驗證，細菌、霉菌及酵母菌計數采用培養基稀釋法，控制菌檢查采用常規法。結果細菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%，控制菌檢查中，各陽性試驗菌均檢出，陰性對照無菌生長。結論該法可消除雌呋栓的抑菌作用，適用于該制劑的微生物限度檢查。

雌呋栓;微生物限度檢查;方法學驗證

雌呋栓用于女性缺乏雌激素、子宮嚴重萎縮、慢性陰道炎及老年性陰道炎等疾病的治療。為有效控制藥品的質量，保證微生物限度檢查方法的科學性和檢驗結果的準確性，筆者根據《中國藥典》2010年版［1］附錄微生物限度檢查的新要求，對雌呋栓進行了微生物限度檢查的方法學驗證。

1 材料

1.1 培養基與試劑 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴化十六烷三甲基三甲銨瓊脂培養基、無菌十四烷酸異丙酯。以上均由中國食品藥品檢定院提供。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］、大腸埃希氏菌［CMCC(B)44 102］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10 104］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98 003］。以上均由中國食品藥品檢定院提供。

1.3 樣品 雌呋栓，哈爾濱某醫院提供(批號為20101228、20101229、20101230)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮斜面培養物接種于營養肉湯培養基中，在30～35℃培養18～24 h;接種白色念珠菌的新鮮斜面培養物至改良馬丁培養基中，在23～28℃培養24 h，分別取上述培養液用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍依次稀釋至濃度約為50～100cfu/ml備用。取黑曲霉菌新鮮斜面培養物，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液［2］適量將孢子洗下，并用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至濃度約為50～100cfu/ml，備用。

2.2 供試液的制備 取本品10 g，加至含20 ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的適宜容器內，置40～45℃保溫，充分振搖使溶解，加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，萃取5～10 min，靜止，取水層作為1：10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

2.3.1 試驗組 取1：10供試液1 ml，分別等量加入5個平皿中(每皿0.2 ml)，加入各試驗菌1 ml，加入相應瓊脂培養基，按規定條件培養，計細菌、霉菌及酵母菌數(n=3)。

2.3.2 菌液組 吸取上述稀釋的陽性菌菌液各1 ml至平皿中，立即傾入相應的培養基，置規定條件培養，計各陽性菌的菌落數(n=3)

2.3.3 供試品對照組 測定樣品本底的菌數，方法同試驗組，不加陽性對照菌(n=3)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取試驗用稀釋劑代替供試液測定，方法同試驗組(n=3)。

2.3.5 回收率結果 試驗組菌回收率%=(試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。稀釋劑對照組菌回收率%=稀釋劑對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數×100%。平均回收率結果見表1。

表1 細菌、霉菌及酵母菌方法驗證的平均回收率(%)

從表1可以看出，5株試驗菌的試驗組菌回收率與稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，因此，可采用該法測定樣品的細菌、霉菌及酵母菌數。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 試驗組 取2份1：10的供試液(每份10 ml)，分別接種至營養肉湯培養基、沙氏葡萄糖液體培養基各500 ml中，再分別加入陽性對照菌金黃色葡萄球菌和白色念珠菌菌液各1 ml，置規定條件培養;另取1：10的供試液10 ml，加膽鹽乳糖培養基100 ml，再加入陽性對照菌銅綠假單胞菌液1 ml，置30 ～35℃培養 18～24 h。

2.4.2 陰性對照組 取等量稀釋劑，方法同試驗組(不加陽性對照菌液)。

2.4.3 驗證結果 試驗組檢出陽性試驗菌，陰性對照組無菌生長，見表2。

表2 控制菌檢查方法學驗證結果

從表2看出該控制菌檢查方法適用于本品的檢查。

3 討論

3.1 雌呋栓為陰道用藥，按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法要求，增加了對白色念珠菌的檢查;

3.2 控制菌檢查中取消了陰性對照菌(大腸埃希氏菌)試驗，取而代之以測定所用稀釋劑作為陰性對照組進行試驗;

3.3 經方法學試驗，雌呋栓具有一定抑制微生物生長的作用，采用稀釋基稀釋法(細菌、霉菌及酵母菌檢查取五皿，每皿加樣0.2 ml;控制菌檢查培養基用量為500 ml)可有效去除樣品中的抑菌作用，為臨床用藥提供質量保證。

［1］ 中國藥典.二部，2010：107-116.

［2］ 李云龍.中國藥品檢驗標準操作規范.北京：中國醫藥科技出版社，2010：400.

150001黑龍江省食品藥品檢驗檢測所