液相色譜－串聯質譜分離鑒定樹莓葉中黃酮類化合物

葉曉珂，秦 沛，李 偉，郭 璐，唐偉偉，王 碩

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全省部共建教育部重點實驗室，天津 300457）

液相色譜－串聯質譜分離鑒定樹莓葉中黃酮類化合物

葉曉珂，秦 沛，李 偉，郭 璐，唐偉偉，王 碩

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全省部共建教育部重點實驗室，天津 300457）

樹莓葉作為一種新的黃酮資源，為了分析鑒定其黃酮類化合物的結構，采用高效液相色譜－二極管陣列－離子阱多級質譜（HPLC-PDA-MSn）聯用技術分離鑒定樹莓葉乙醇提取物中的黃酮類化合物。通過離子阱多級質譜提供的準分子離子峰和多級碎片離子信息，分析得到了黃酮類化合物的相對分子質量、黃酮糖苷的組成結構、黃酮糖苷中糖的類型和多糖鏈的連接次序等。結合液相色譜相對保留時間、標準品和相關文獻對照，對樹莓葉乙醇提取物中的15個黃酮類化合物的可能結構進行推斷。結果表明，樹莓葉中有8個槲皮素衍生化的黃酮化合物和7個山奈酚衍生化的黃酮化合物，這與樹莓中主要含有槲皮素和山奈酚衍生化的黃酮化合物報道一致。

樹莓葉；黃酮類化合物；分離鑒定；液相色譜－質譜法（HPLC-MSn）；離子阱

樹莓（Rubusidaeus）是薔薇科懸鉤子屬多年生落葉小灌木植物，又名山莓、三葉泡、覆盆子、托盤、馬林、梅子、插田泡等，我國野生樹莓資源非常豐富。近年來，樹莓果作為一種新型的果品加工類型和其獨特的保健作用［1］，引起了國內外廣泛的研究。樹莓全株都含有黃酮類化合物，尤以樹莓葉中黃酮成分最為豐富。張敏［2］測得山莓葉中總黃酮含量為1.18mg/g。Venskutonis等［3］在樹莓葉的乙醇提取物中鑒定出槲皮素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素-3-β－葡萄糖醛酸苷，蘆丁。Lee等［4］從懸鉤子植物RhodiolasachalinensisA.Bor中分離出山奈酚。國外學者對該屬植物的黃酮類成分進行研究，并對其中6個黃酮化合物的結構進行了鑒定［5］。國內學者［6－8］從本屬植物中分離出兒茶素、山萘素苷、異鼠李素等黃酮類化合物。

目前，隨著電噴霧離子（ESI）軟電離技術的迅速發展，高效液相色譜－質譜（HPLC/MS）聯用技術已成為分析天然產物復雜體系中微量化學成分強有力的工具。利用質譜這個具有高靈敏度的廣譜檢測器，不僅可以獲得物質的相對分子質量，而且還可以利用碎片離子獲得一些結構信息，尤其是借助多級串聯質譜（MS/MS）可獲得更為詳細而系統的結構信息，從而實現黃酮等天然產物的在 線 結 構 鑒 定［9－11］。袁 帥 等［12］利 用HPLC-ESI-MS/MS技術識別了藍莓提取物中的 黃 酮 醇 類 化 合 物。Colombo 等［13］利 用LC/MS技術研究了甘蔗渣和甘蔗葉中的黃酮類化合物，共鑒定出7種化合物。

本工作利用高效液相色譜－二極管陣列－離子阱多級質譜（HPLC-PDA-MSn）聯用技術分析鑒定樹莓葉乙醇提取物中的黃酮類化合物，為樹莓葉中功能性活性成分的鑒定和研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

LCQ液相色譜－質譜聯用儀：美國Finnigan公司產品，配有Suveyor二極管陣列（PDA）檢測器、電噴霧離子源（ESI）、LCQ 離子阱（ion trap）及Xcalibur1.4數據處理系統；Hypersil GOLD色譜柱（100mm×2.1mm×3μm）：美國Thermo公司產品；Centrifuge 5804R臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司產品；Millipore超純水系統：美國 Millipore公司產品；VGT-1730QT超聲波清洗儀：美瑞泰克公司產品。

1.2 材料與試劑

樹莓葉于10月份采摘于北京延慶樹莓種植園。

乙腈、甲醇（色譜純）：美國 Merck公司產品；無水乙醇、乙酸、石油醚（分析純）：天津市化學試劑一廠公司產品；水為經Millipore超純水系統處理過的超純水。

1.3 樣品處理方法

準確稱取0.500 0g樹莓葉片粉末，加入10 mLV（乙醇）∶V（水）＝75∶10的溶液，65℃超聲波中提取1h，在4℃下，4 500r/min離心分離20min，重復提取2次，收集濾液，備用。提取液用20mL石油醚反復萃取，除色素。取2.5 mL提取液，置于25mL容量瓶中，甲醇定容，稀釋10倍。取1mL上述溶液，經0.22μm微孔有機濾膜過濾后進樣。

1.4 實驗條件

1.4.1 色 譜條 件 Hypersil GOLD 色 譜 柱（100mm×2.1mm×3μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈（A）和含0.1%乙酸的水（pH 3.2）（B）；梯度洗脫：0～5min 15%～30%A，5～10min 30%～35%A，10～15min 35%～45%A，15～20min 45%～50%A，20～25min 50%～15%A，25～35min 15%A；流速：0.2mL/min；自動進樣器進樣量：10μL；二極管陣列檢測器（PDA）全掃描波長：230～400nm。

1.4.2 質譜條件 電噴霧（ESI）離子源；毛細管溫度275℃；電噴霧電壓4.5kV；鞘氣流速9 L/min；輔助氣流速1.5L/min；掃描方式：負離子模式下全掃描；質量掃描范圍：m/z100～700；離子阱多級串聯質譜，選取各組分苷元為母離子（precursor ion），多級質譜分析采用50%的碰撞歸一化能量。

2 結果與討論

標準品山奈酚的相對分子質量為286，在負離子掃描模式下很容易丟失一個H，得到m/z285的準分子離子峰［M－H］-，示于圖1a，在MS2中，準分子離子峰［M－H］-285失去一個中性小分子CO［M－28－H］-，得到m/z257的碎片離子；再失去一個中性小分子CH2［M－28－14－H］-，得到m/z243的碎片離子，若是失去一個中性小分子CO2［M－28－44－H］-，形成m/z213的碎片離子，示于圖1b。

標準品槲皮素的相對分子質量為302，在負離子掃描模式下很容易丟失一個H，得到m/z301的準分子離子峰［M－H］-，示于圖2a，在MS2中，準分子離子峰［M－H］-301的C環發生逆－狄爾斯－阿爾德（RDA）裂解，易產生 Ai，j-和Bi，j－

離子，1/3兩個化學鍵發生斷裂，產生 A1，3－或者 B1，3-離子，其中 A1，3－m/z151；0/4兩個化學鍵發生斷裂，產生［B0，4＋H］-m/z179的碎片離子，示于圖2b，其斷裂方式示于圖3。

對樹莓葉乙醇提取物在上述實驗條件下進行分析，共發現15種黃酮類化合物，其提取質譜總離子流圖（EIC），示于圖4。

把這15種物質作為母離子，碰撞歸一化能量為50%，進行二級、三級、四級串聯質譜分析，得到多級質譜碎片信息，列于表1。通過對15種物質的多級質譜碎片信息分析，可以推測出這些物質是由槲皮素和山奈酚衍生化的黃酮糖苷類化合物。

2、3、4、5、6、8、14號物質的 MS3碎片和7號物質的MS4碎片151，179剛好與標準品槲皮素的特征碎片離子相同，表明2、3、4、5、6、7、8、14號物質是槲皮素衍生化的黃酮糖苷；1、9、10、12、13、15號物質的 MS3碎片和11號物質的MS4碎片剛好與標準品山奈酚的特征碎片離子相同，表明1、9、10、11、12、13、15號物質是山奈酚衍生化的黃酮糖苷。

圖1 山奈酚標準品在負離子掃描模式下的電噴霧質譜圖（a）及其二級質譜圖（b）Fig.1 ESI-MS spectrum of standard kaempfeol（a）and its MS2 spectrum（b）in negative ion mode

圖2 槲皮素標準品在負離子掃描模式下的電噴霧質譜圖（a）及其二級質譜圖（b）Fig.2 ESI-MS spectrum of standard quercetin（a）and its MS2 spectrum（b）in negative ion mode

圖3 槲皮素斷裂方式Fig.3 Fragmentation of quertetin

黃酮類化合物主要以游離態或者與糖結合成苷的形式存在于自然界中，在質譜檢測中，若對其施加一定的電壓，很容易丟失中性碎片或者單（多）糖殘基，骨架上每減少一個取代基，其相對分子質量相應有所減少。例如，羥基減17；甲氧基減30；氧鍵相連的六碳糖減162，如葡萄糖、半乳糖；氧鍵相連的糖醛酸減176，如葡萄糖醛酸；氧鍵相連的六碳去氧糖減146，如鼠李糖；氧鍵相連的五碳糖減132，如阿拉伯糖；氧鍵相連的二糖減308，如蕓香糖。同時根據碎片斷裂的不同順序，還可以確定糖的連接次序［14］。因此，根據此規律以及文獻中的報道，對這15種黃酮化合物的結構進行了推斷。

圖4 樹莓葉中15種黃酮化合物的提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatograms（EIC）of 15components of flavonoids in leaves of Rubusidaeus

1、9號峰，m/z都為461，即［M－H］- 為461，在1號峰的 MS2中，產生m/z285的二級碎片離子，即 ［M－H－176］-，失去一個葡萄糖醛酸殘基；在MS3中，m/z285的二級碎片離子產生m/z257的三級碎片離子，這與標準品山奈酚的碎片離子相同，因此可以推斷1、9號峰為山奈酚衍生化的黃酮糖苷。Ryan等［15］報道在樹莓中發現山奈酚-3-β－葡萄糖醛酸（kaempferol-3-β-glucuronide），因此1、9號峰推測為山奈酚-3-β－葡萄糖醛酸糖苷，可能由于兩者單糖殘基的空間位置不同，兩者的液相色譜相對保留時間不同，因此兩者為同分異構體，化學式為C21H18O12，相對分子質量為462。

2、10號峰，m/z都為447，即［M－H］-為447，根據一級質譜很難進行區別，但在MS2中，2號峰產生m/z301的二級碎片離子，即［MH－146］-，失去一個鼠李糖殘基；10號峰產生m/z285的二級碎片離子，即［M－H－162］-，失去一個葡萄糖殘基。在MS3中，2號峰的二級碎片離子m/z301產生m/z151，179的三級碎片離子，這與標準品槲皮素的碎片離子相同；10號峰的二級碎片離子m/z285產生m/z257的三級碎片離子，這與標準品山奈酚的碎片離子相同，因此，2、10號峰分別為槲皮素和山奈酚的衍生化黃酮類糖苷。根據2號峰失去一個脫氧己糖殘基［16］即鼠李糖殘基，產生m/z301的二級碎片離子，推測2號峰為槲皮素-3-O-鼠李糖苷（quercetin-3-O-rhamnoside）；根據10號峰失去一個葡萄糖殘基，產生m/z285的二級碎片離子，推 測 為 山 奈 酚-3-O-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷（kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside）［17］。 因此，2、10號峰化學式為C21H20O11，相對分子質量為448。

3、7號峰，m/z為609，即［M－H］-為609，3號峰在MS2中，產生m/z301的碎片離子，即［M－H－308］-，失去一個蕓香糖殘基；7號峰在MS2中，產生m/z447的二級碎片離子，即［M－H－162］-，在 MS3中，產生m/z301的三級碎片離子，即［M－H－162－146］-。根據兩者的碎片信息可知，3號峰直接產生m/z301的二級碎片離子，沒有出現任何中間碎片離子；7號峰的三級碎片離子也為m/z301的離子，但7號峰出現了中間碎片離子，即m/z447的二級碎片離子。3號峰的這種沒有出現中間碎片離子的斷裂為蕓香糖苷特有的斷裂方式，因此，3號峰推斷為槲皮素-3-O-蕓香糖苷（quercetin-3-O-rutinoside），也即蘆丁（rutin），是一種廣泛存在于植物中黃酮類化合物。根據7號峰的二級、三級碎片信息，推測為槲皮素-3-O-葡萄糖－鼠李糖苷（quercetin-3-O-glucosylrhamnoside）。兩者的化學式為C27H30O16，相對分子質量為610。

4、8號峰，m/z都為433，即 ［M－H］- 為433，在 MS2中，產生m/z301的碎片離子，即［M－H－132］-，失去一個阿拉伯糖殘基或者木糖殘基。Wang等［18］報道在該屬植物Rubus pungens中 發 現 槲 皮 素-3-O-α－阿 拉 伯 糖 苷（quercetin-3-O-α-arabinopyranoside）。因 此，4、8號峰推測為槲皮素-3-O-α－阿拉伯糖苷，可能由于兩者單糖殘基的空間位置不同，兩者在液相色譜柱的流出時間不同，因此推測兩者為同分異構體，化學式為C20H18O11，相對分子質量為434。

5號峰，m/z為463，即［M－H］-為463，在MS2中，產生m/z為301的碎片離子，即［MH－162］-，失去一個葡萄糖基或者半乳糖基。Gudej等［19］報道在樹莓葉中發現有槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside），在同屬植物Rubuscoreanum中也發現有此類物質。因此5號峰為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，化學式為C21H20O12，相對分子質量為464。

表1 樹莓葉乙醇粗提取物中黃酮類化合物保留時間、多級質譜特征離子碎片Table 1 Retention time and fragments ions of flavonoids in leaves of Rubusidaeus

6號峰，m/z為477，即［M－H］-為477，在MS2中，產生m/z301的碎片離子，即［M－H－176］-，失去一個葡萄糖醛酸殘基。Lee等［20］報道在同屬植物Rubuscoreanum中發現槲皮素－3－β－葡萄糖醛酸（quercetin-3-β－glucuronide）。因此6號峰為槲皮素-3-β－葡萄糖醛酸糖苷，化學式為C21H18O13，相對分子質量為478。

11、15號峰，m/z為593，即 ［M－H］- 為593，11號峰在MS2中，產生m/z477的二級碎片離子，即［M－H－146］-，失去一個鼠李糖殘基。在 MS3中，m/z477產生m/z285的三級碎片離子，即［M－H－146－162］-，失一個葡萄糖殘基。然而，15號峰在 MS2中，直接產生m/z285的碎片離子，即［M－H－308］-，失去一個蕓香糖殘基。根據對3、7號峰的碎片斷裂機理的討論，可以推斷11號峰為山奈酚-3-O-葡萄 糖－鼠 李 糖 苷 （kaempferol-3-O-glucosylrhamnoside），15 號 峰 為 山 奈 酚-3-O-蕓 香 糖 苷（kaempferol-3-O-rutinoside）。兩者的化學式為C26H28O15，相對分子質量為594。

12號峰，m/z為417，即［M－H］-為417，在MS2中，產生m/z285的碎片離子，即［MH－132］-，失去一個阿拉伯糖殘基或者木糖殘基。Wang等［18］報道在同屬植物樹莓Rubus pungens中發現有山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷（kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside）。因此12 號 峰 推 測 為 山 奈 酚-3-O-阿 拉 伯 糖 苷（kaempferol-3-O-arabinopyranoside），化學式為C19H16O10，相對分子質量為418。

13號峰，m/z為469，即［M－H］-為469，在MS2中，產生m/z285的碎片離子，且m/z285的碎片離子為267、225，因此可以確定13號峰是含有山奈酚的黃酮糖苷，相對分子質量為470。

14號峰，m/z為517，即［M－H］-為517，在MS2中，產生m/z301的碎片離子，即［MH－216］-，失去一個中性碎片，且m/z301的碎片離子為179、151，因此可以確定14號峰是含有槲皮素的黃酮糖苷，相對分子質量為518。

樹莓葉乙醇提取物中黃酮類化合物結構的推斷列于表2。

3 結論

通過對樹莓葉乙醇提取物 HPLC-PDAMSn分析，檢測出15種黃酮化合物，主要是槲皮素和山奈酚衍生化的黃酮醇類化合物，這與文獻中的報道一致。通過對這15種黃酮化合物的一級和多級質譜碎片信息的分析，對其基本結構組成進行初步的推斷。但對于糖基具體的空間結構的鑒定還需要通過對目標化合物進行高度純化后，結合核磁等手段進行準確的結構判斷。該方法簡單、原料前處理便捷、同時具有靈敏度高等特點，可實現黃酮類化合物快速的初步定性研究，對于天然產物復雜體系中活性成分的初步定性研究也具有重要的意義。

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Separation and Identification of Flavonids of Leaves of Rubus idaeus by High Performance Liquid Chromatography Electrospray Ionization Multi-Stage Tandem Mass Spectrometry

YE Xiao-ke，QIN Pei，LI Wei，GUO Lu，TANG Wei-wei，WANG Shuo
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457）

To analysis and determinate the construction of flavonids in the leaves of raspberry as a new flavonids resource，the utility of high performance liquid chromatograph in combined with photodiode array detection and mass spectrometer technology （HPLC-PDAMSn）was successfully applied to simultaneous separate and determinate 15flavonoides in ethanol extracts of leaves ofRubusidaeus.It was analyzed that constructions of flavonoid aglycones，the types of glycogen，sequences of polysaccharide using the information of molecular weight and ion fragmentations of MSnprovided by ion trap.In addition to liquid chromatography retention time，standard materials and published reports，the possible construction of 15flavonoids in ethanol extracts was inferred.The result shows that it contains 8quercetin derivatives and 7kaempferol derivatives，which was corresponded with the pub-lished reports.

leaves ofRubusidaeus；flavonoids；separation and determination；HPLC-MSn；ion trap

O 657.63

A

1004-2997（2011）05-0271-07

2011-01-15；

2011-06-14

葉曉珂（1986～），女（漢族），河南漯河人，碩士研究生，食品科學專業。E-mail：yexiaoke1986＠sina.com

王 碩（1969～），男（漢族），天津人，博士生導師，從事食品營養與安全研究。E-mail：s.wang＠tust.edu.cn