Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體處方

武鑫朋，孫李妍，2，慕宏杰，楊紹梅，魏俊花，周繡棣，陳大全

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺(tái)264005;2.煙臺(tái)山醫(yī)院，山東煙臺(tái)264001)

牛蒡苷(arctiin，AC)具有顯著的抗菌，抗病毒，抗腫瘤，抗PAF受體作用，在體內(nèi)被分解為牛蒡苷元而產(chǎn)生眾多藥理作用，具有很高的新藥開發(fā)價(jià)值。經(jīng)家兔靜脈注射牛蒡苷元10 mg·kg－1，其藥物動(dòng)力學(xué)行為符合單室模型，消除半衰期t1/2(Ke)為52.164 73 min，藥物體內(nèi)消除較快，故該藥較適合制成緩釋劑型［5～8］。鑒于人體陰道pH值為4～5，本研究將其設(shè)計(jì)為pH敏感脂質(zhì)體，并初步考察其穩(wěn)定性，擬為今后研制其凝膠劑型及其體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

Box－Behnken效應(yīng)面法是Design Expert(7.1.4試用版，Stat－Ease Inc)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件中的一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，許多國外藥學(xué)工作者已將其用于制劑處方的優(yōu)化，而國內(nèi)仍為少見。作者采用薄膜分散法制備了牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體，并采用Box－Behnken效應(yīng)面法對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化［9］。

本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體，通過Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選處方并對(duì)其進(jìn)行一系列性質(zhì)研究。

1 儀器與試藥

RE252A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，NicompTM 380動(dòng)態(tài)光散射粒度測定儀(SantaBarbara，USA PSS)，JM21200EX透射電鏡(日本電子公司)。

牛蒡苷(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.15%，東北制藥總廠)，大豆磷脂(注射級(jí)，上海太偉藥業(yè)有限公司)，膽固醇(生化級(jí)，天津博迪化工有限公司)，pH敏感材料mPEG2000－Hz－Chol(PHC)(實(shí)驗(yàn)室自己合成)，三氯甲烷、甲醇(色譜純，山東禹王試劑有限公司)，其他試劑(分析純，市售)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 AC脂質(zhì)體的制備

2.1.1 AC脂質(zhì)體的制備 稱取處方量的AC原料藥、大豆磷脂、膽固醇、PHC，溶于適量三氯甲烷中，置于250 mL茄形瓶中，在42℃減壓除去有機(jī)溶劑，得到透明均勻薄膜，繼續(xù)抽真空10 min后，加入磷酸鹽緩沖液(pH值為7.2)，在20℃條件下超聲水化磷脂膜30 min后過0.45 μm微孔濾膜，得到略帶乳光脂質(zhì)體混懸液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

在河湖周邊區(qū)，結(jié)合平原區(qū)造林，在城市河道兩側(cè)50～100 m范圍內(nèi)，按照喬灌草立體配置模式，建設(shè)河濱植物過濾帶，進(jìn)一步過濾、凈化入河水質(zhì)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)條件篩選 a.按2.1.1中處方，將茄形瓶改為50 mL和500 mL體積，其余操作同上制備脂質(zhì)體;b.按2.1.1中處方，將溫度改為38℃和45℃，其余操作同上制備脂質(zhì)體;c.按2.3步驟測定脂質(zhì)體包封率和載藥量并進(jìn)行比較，結(jié)果:選擇250 mL茄形瓶，設(shè)定旋蒸溫度為42℃制備脂質(zhì)體，此時(shí)得到的脂質(zhì)體包封率及載藥量最高。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法篩選 按照2.1.1中處方，分別采用逆向蒸發(fā)法、注入法、pH梯度法等制備脂質(zhì)體，并測其包封率，結(jié)果:薄膜分散法所制備的脂質(zhì)體包封率最高。

2.2 含量測定方法學(xué)的建立［8～10］

2.2.1 檢測波長選擇 分別稱取AC對(duì)照品與空白輔料適量，加甲醇溶解，配制成一定濃度的AC和輔料溶液，分別在200～400 nm內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。AC在280 nm處有最大吸收，且空白輔料不干擾測定，選定檢測波長為280 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取AC對(duì)照品置量瓶中，以甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.102 mg·mL－1貯備液，稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.0102、0.0204、0.0306、0.0408、0.051、0.0612 mg·mL－1溶液。按“2.2.1”在280 nm處測定吸光度(A)，以吸光度(A)對(duì)藥物質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=16.509×C+0.008 9(R2=0.999 9)。結(jié)果表明，AC質(zhì)量濃度在0.010 2～0.061 2 mg·mL－1內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)、日間精密度良好，RSD均小于2%。

2.3 AC脂質(zhì)體包封率及載藥量的測定 采用過膜法測定脂質(zhì)體的包封率。精密量取脂質(zhì)體0.3 mL置10 mL量瓶中，甲醇定容，按“2.2.2”中UV法測定溶液中AC含量。藥物包封率(entrapment efficiency，EE)、載藥量(loading content，LC)計(jì)算公式如下:EE%=ρ測 /ρ總×100;LC%=(m總－m游離)/m脂質(zhì)×100。式中ρ總、ρ測分別代表投入脂質(zhì)體溶液中AC的總質(zhì)量濃度、被包封AC的質(zhì)量濃度;m測、m脂質(zhì)分別代表單位體積脂質(zhì)體包封AC的量以及制備單位體積脂質(zhì)體所用脂質(zhì)的量。

2.4 脂質(zhì)體粒徑的測定 動(dòng)態(tài)光散射粒度測定儀測定牛蒡苷脂質(zhì)體的粒徑大小及分布，結(jié)果如圖1，表明脂質(zhì)體粒徑在228 nm左右，呈正態(tài)分布。

圖1 牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體粒徑分布

2.5 Box－Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方試驗(yàn) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)影響較顯著的3個(gè)因素:磷脂－膽固醇比(X1)、磷脂－藥質(zhì)量比(X2)、pH敏感材料含量(X3)作為考察對(duì)象。以包封率(Y1，EE)、載藥量(Y2，LC)及粒徑(Y3，d)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，安排試驗(yàn)，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 Box－Behnken設(shè)計(jì)因素水平

2.5.1 二次回歸模型的建立 利用Box－Behnken實(shí)驗(yàn)軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸模型為:

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5.2 方差分析和顯著性檢驗(yàn) 以上擬合方程的相關(guān)系數(shù)說明設(shè)計(jì)模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)AC脂質(zhì)體的處方進(jìn)行分析和預(yù)測。從r2來看，3個(gè)指標(biāo)均以二項(xiàng)式擬合度較優(yōu)。3個(gè)考察指標(biāo)中包封率和粒徑與自變量之間呈顯著相關(guān)性。從表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，模型(1)中X1(P＜0.000 1)、X2(P=0.000 1)項(xiàng)極顯著，其他項(xiàng)不顯著;模型(2)中X2(P=0.000 5)、X22(P=0.003 9)顯著，其他項(xiàng)不顯著;模型(3)中X1(P＜0.000 1)、X12(P=0.000 1)顯著，其他項(xiàng)不顯著。

表3 回歸方程中的顯著性系數(shù)

表4 按照最優(yōu)處方制備的牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體實(shí)驗(yàn)觀察值與模型預(yù)測值

2.5.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 按照二項(xiàng)式擬合方程描繪效應(yīng)對(duì)各因素的效應(yīng)面，本試驗(yàn)欲控制納米粒徑在＜200 nm范圍內(nèi)，并取得較高的收率和包封率。根據(jù)上述分析的結(jié)果，效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件繪制各指標(biāo)與影響較顯著的2個(gè)自變量的三維曲面圖(另一自變量設(shè)為中心點(diǎn)值，圖2)，設(shè)計(jì)各指標(biāo)權(quán)重，得到優(yōu)化后處方(X1=4.36，X2= 10.01，X3=1.32)。按此處方制備了3批脂質(zhì)體，其包封率、載藥量和粒徑見表4。從表4可知，實(shí)驗(yàn)觀察值和模型預(yù)測值都比較接近，模型的預(yù)測性良好。

圖2 考察因素與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)曲面圖

2.6 AC脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察

2.6.1 性狀 本品為均勻，細(xì)膩，黏稠的乳白色液體。

2.6.2 pH值 取本品5.0g，加100 mL蒸餾水稀釋，攪拌5 min，測定pH值在6.0～7.0之間。

2.6.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) a.將脂質(zhì)體裝入無菌安瓿中，封口，分別在冰箱(4℃)、室溫(22℃)和60℃下放置24 h，觀察其性狀并測定包封率;b.將脂質(zhì)體裝入無菌安瓿中，封口，給與光照24 h，測包封率;c.將脂質(zhì)體裝入無菌安瓿中，封口，分別在室溫下放置一周、兩周、一個(gè)月，測包封率結(jié)果:脂質(zhì)體在冰箱和室溫下可以穩(wěn)定保存，室溫下保存一個(gè)月后包封率基本沒有變化，說明該法制得的脂質(zhì)體性質(zhì)穩(wěn)定不易泄漏;而對(duì)于光照和60℃條件表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。

2.7 形態(tài)學(xué)觀察(TEM) 取適量牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體溶液滴在噴碳銅網(wǎng)表面，使液體盡量鋪滿整個(gè)銅網(wǎng)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%磷鎢酸負(fù)染3 min后，于透射電鏡下觀察形態(tài)。從圖3可以看出，牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體為球形或類球形粒子，大小均一，結(jié)構(gòu)完整。

圖3 透射電鏡下牛蒡苷pH敏感脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)

3 討論

3.1 在脂質(zhì)體單因素(磷脂－膽固醇比(X1)、磷脂－藥質(zhì)量比(X2)、pH敏感材料含量(X3))考察過程中發(fā)現(xiàn)，影響脂質(zhì)體性質(zhì)的因素主要是磷脂－膽固醇比(X1)、及磷脂－藥質(zhì)量比(X2)。因此以這3個(gè)因素為考察對(duì)象，以包封率、載藥量及粒徑為考察指標(biāo)進(jìn)行Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

3.2 根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，影響包封率和載藥量的最主要因素為磷脂－膽固醇比(X1)和磷脂－藥質(zhì)量比(X2)，根據(jù)圖2中的圖A和B可知，包封率和載藥量隨著磷脂－膽固醇比的增大呈先增大后減小的趨勢，原因可能為磷脂質(zhì)量濃度增加，形成的脂質(zhì)體增多，其粒徑也增大，包封在脂質(zhì)體內(nèi)藥物相應(yīng)增多，因而能包載更多藥物及藥物膠束，包封率相應(yīng)提高，同時(shí)載藥量也相應(yīng)增大。但是磷脂質(zhì)量濃度過大，相同投藥量下的載藥量下降，而且形成的脂質(zhì)體容易聚集融合，導(dǎo)致藥物泄漏，使得載藥量和包封率降低。

3.3 由圖2中圖C可知，脂質(zhì)體粒徑大小受磷脂－膽固醇比(X1)影響最大，而磷脂－藥質(zhì)量比(X2)影響較小，粒徑隨著磷脂量的增多而增大。

3.4 pH敏感材料含量(X3)對(duì)脂質(zhì)體的包封率、載藥量和粒徑的影響都較小，根據(jù)參考文獻(xiàn)［2～4］可知，以該材料修飾合成的脂質(zhì)體在體內(nèi)可表現(xiàn)良好的pH敏感性，為后期進(jìn)行pH敏感脂質(zhì)體體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過Box－Behnken效應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化了牛蒡苷脂質(zhì)體的處方，按此處方制備了3批脂質(zhì)體，包封率、載藥量和粒徑實(shí)測值與預(yù)測值的偏差均較小，說明該方法預(yù)測性能較好，可以準(zhǔn)確的優(yōu)化牛蒡苷脂質(zhì)體的處方;通過對(duì)優(yōu)化后脂質(zhì)體處方的粒徑測定結(jié)果可知，含有pH敏感材料的脂質(zhì)體粒徑均在228 nm左右，通過透射電子顯微鏡觀察，脂質(zhì)體大小分布均勻，結(jié)構(gòu)完整，為下一步的體內(nèi)研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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