新型免疫抑制劑 Sanglifehrin A發(fā)酵工藝的優(yōu)化

彭招全,王 普,蔡 謹,黃 磊,徐志南

(1.浙江工業(yè)大學藥學院,浙江杭州 310032;2.浙江大學化學工程與生物工程系,浙江杭州 310027)

Sanglifehrin A(SFA)是由鏈霉菌產生的一種新型大環(huán)內酯類抗生素,其化學結構如圖 1所示。生物體免疫活性在分子水平上與親環(huán)蛋白的調節(jié)作用是分不開的,而在細胞水平上主要與 T細胞、B細胞和樹突細胞有關。因 SFA與親環(huán)蛋白有較強的親和力而表現出強大的免疫抑制活性,它與親環(huán)蛋白的親和力是目前常用的免疫抑制劑——親環(huán)菌素 A的 20倍[1],并且不會影響鈣調磷蛋白活性。SFA不僅能阻斷細胞周期 G1階段的 T細胞增殖[2],而且能在不影響 B細胞抗體合成的情況下,阻斷 B細胞增殖[3]。樹突細胞胞吞作用、攝取抗原和分泌白細胞介素 -12等免疫功能也受 SFA抑制[4,5]。此外,SFA還能抑制線粒體通透性轉運孔的打開,保護心肌細胞免受缺血/再灌注損害[6]。它還能用來治療丙型肝炎及肝纖維化、慢性間質性肝炎和肝細胞性肝癌等疾病[7]。然而,目前國內外報道的 SFA發(fā)酵水平都較低,在0.1～2 mg·L-1左右[1,8],而化學法合成的步驟繁冗復雜,產率很低[9]。因此,提高 SFA發(fā)酵水平成為 SFA真正走向市場的瓶頸。

埃森曼在對“向日葵”住宅的解讀中，通過將虛體變?yōu)閷嶓w來概念化空間[7]17。這種虛體被包容在物質的邊界里，這就是空間，也可以理解為格伯利尼提及的相互交流符號?？臻g由于界定物質的不同，是存在方向性的，繼而產生不同的“所指”。大理傳統(tǒng)民居是內向型的空間，但對比兩個案例，攬清在圍合內部院落的同時，院落與房間都朝向于洱海，外向型空間傳達的“所指”是地塊優(yōu)異的風景條件；既下山在外圍增加了大量的開窗，框景似的朝向熙攘的街道，形成大理當地人文氣息的所指。

本文從新構建的重組 Streptom yces flaveolusDS M 9954出發(fā),探討發(fā)酵條件對提高其 SFA發(fā)酵水平的影響,為 SFA工業(yè)化發(fā)酵生產提供實驗依據。

圖1 SFA的化學結構式

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌種 Streptom yces flaveolusDS M 9954,浙江大學生物工程研究所保藏。

1.1.3 種子培養(yǎng)基 (g·L-1) 甘油 40,大豆蛋白胨 10,麥芽浸膏 21,pH 7.0。

1.1.2 斜面培養(yǎng)基 (g·L-1) 可溶性淀粉 10.0,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 1.0,NaCl 1.0,(NH4)2SO42.0,CaCO32. 0,FeSO4·7H2O 0.001,MnCl2·7H2O 0.001,瓊脂 20,pH 7.0。

2.1 種齡和接種量對 SFA產量的影響 實驗發(fā)現,Streptomyces flaveolusDS M 9954種齡和接種量對 SFA發(fā)酵的影響較大,結果見表 1和圖 1。種齡為 30 h的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵效價最高,為 2.01 mg·L-1。這說明適齡的種子液可以提供足夠多的、生長旺盛的種子。接種量過低,會造成發(fā)酵延遲,發(fā)酵的效率降低;而接種量過大時,營養(yǎng)物質消耗過快,影響了后續(xù)次級代謝產物的合成,從而造成 SFA產量下降。從圖 1可知,6%接種量可達到最高的發(fā)酵水平。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 (g·L-1):麥芽糖 40,黃豆餅粉 40, (NH4)2SO42.0,CuSO4·5H2O 0.0587,ZnSO4·7H2O 0.5, CaCO34.0,pH 7.0。

1.3 SFA含量測定 樣品處理:將 25 mL發(fā)酵液與 25 mL乙酸乙酯混合,超聲波處理并快速均勻攪拌 20 min,4 000 rpm離心 10 min,提取上層有機相,真空旋蒸至干,加入 1 mL甲醇溶解,過濾后作液相分析。

1.2.1 菌種保藏 斜面培養(yǎng) 6～7 d,收集孢子,懸浮于 20%甘油,冷凍保存。

該模塊在設計和開發(fā)中采用了開放的、可擴展的基于服務的軟件體系結構，使其可以無縫集成到已有的系統(tǒng)以及新開發(fā)的系統(tǒng)當中，為其他應用系統(tǒng)提供預警服務。同時，采用了自適應的實時數據掃描算法，當在需要預警的時間段內未掃描到水雨情數據時，引擎會自動縮短數據掃描時間，若在一段時間內仍未獲取數據，才判定數據并不存在，恢復預設的掃描時間。此特性可防止因網絡堵塞或故障帶來的數據傳輸延遲而造成數據遺漏的情況，同時也保證了預警數據的實時性。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 按 4%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng) 120 h,搖床轉速為 250 rpm。

應用熱力學第一定律對循環(huán)流化床鍋爐的計算得到鍋爐各處煙氣溫度以及各換熱器出口溫度進而應用熱力學第二定律進行 分析。

1.2.2 種子培養(yǎng)取 1 mL孢子懸液,接種到 250 mL種子瓶中,培養(yǎng)基裝量 25 mL,25℃培養(yǎng) 24 h,搖床轉速 250 rpm。

1.2 培養(yǎng)方法

高效液相色譜儀分析:高效液相色譜儀安捷倫 1100,色譜柱 (Agilent TC-C18,250 mm×4.6 mm,5μm),進樣量 20 μL,檢測波長 242 nm,流速 1 mL·min-1,柱溫 25℃,流動相為A:水 (0.05%的三氟乙酸);B:乙腈 (0.05%的三氟乙酸)。梯度洗脫條件B:0～5 min 40%,5～14 min 40～60%, 14～25 min 60～70%,25～27 min 70～95%,27～30 min 95～40%。

2 結果與討論

2005—2015年，我國廢水排放量由524.50億t/年增至735.30億t/年，復合增長率達3.44%。

表 1 種齡對 SFA生產的影響

圖2 接種量對 SFA產量的影響

2.2 培養(yǎng)溫度對 SFA產量的影響 Streptom yces flaveolus DS M 9954的發(fā)酵對溫度非常敏感。從圖 3可知,培養(yǎng)溫度對 SFA發(fā)酵影響較大,30℃發(fā)酵時,SFA產量達到最高 (3. 65 mg·L-1)。而當低于或高于 30℃時,產量急劇下降。

第一，小學語文教學中經典誦讀時間過短。當下由于小學語文課堂教學時間有限，教師難以保證課堂教學中經典誦讀所占的時間比重，長此以往學生會逐漸對經典誦讀失去學習積極性與主動性。與此同時，經典誦讀是一個長期不間斷的學習過程，但是小學階段大部分的經典誦讀都是由教師組織進行的，很難保證經典誦讀的連貫性與持續(xù)性，致使課堂教學效果與教學效率較低。

圖3 溫度對 SFA發(fā)酵的影響

2.3 發(fā)酵液初始 pH值對 SFA產量的影響 培養(yǎng)基酸堿性也是影響微生物次級代謝的關鍵因素。從表 2可知,培養(yǎng)基初始 pH值 6.5時,產量達到 4.11 mg·L-1。一方面,這可能是因為與 SFA合成的關鍵酶在中性偏酸性條件下表現出最大活性,另一方面,SFA分子含有酚羥基 (圖 1),中性偏酸性條件更有利于 SFA分子呈電中性,減少了細胞膜對 SFA的電荷效應,有利于 SFA的胞外分泌。

表2 發(fā)酵液初始pH值對 SFA發(fā)酵的影響

2.4 搖床轉速及搖瓶裝液量對 SFA產量的影響 液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質和氧氣的傳質效應會直接影響 SFA發(fā)酵產物的積累。本文以搖床轉速和搖瓶裝液量為考察對象,分析了傳質對 SFA發(fā)酵的影響。Streptom yces flaveolus的 SFA發(fā)酵過程對氧氣和營養(yǎng)傳遞要求較高。結果如圖 4、5所示。搖床轉速為 100 rpm時,SFA產量幾乎為零,這表明低轉速可能不利于培養(yǎng)基中氣體傳質,缺氧導致部分細胞死亡,二氧化碳的積累也會使 SFA合成酶活性降低;但過高的轉速有可能破壞鏈霉菌的菌絲體結構,降低鏈霉菌生產 SFA的能力。當轉速達到 350 rpm時,SFA產量急劇下降。裝液量對 SFA發(fā)酵的影響也很大。裝液量過低造成水分揮發(fā),影響發(fā)酵體系的滲透壓;而過高的裝液量影響了氧的傳質,也容易導致菌體成團,不利于營養(yǎng)物質和氧氣傳遞。搖床轉速及搖瓶裝液量對發(fā)酵產物影響的實驗結果進一步證明了營養(yǎng)物和氧氣的傳質對 SFA等次級代謝產物積累的影響是非常明顯的。這是發(fā)酵規(guī)模放大時需要重點考慮的要素之一。

2.5 SFA發(fā)酵進程 次級代謝產物是微生物發(fā)酵進入穩(wěn)定期后期和衰亡期才產生的、非菌體生長和繁殖必需的物質。在發(fā)酵過程中次級代謝產物會經歷產量逐漸增長、穩(wěn)定和分解三個階段。在菌齡、接種量、發(fā)酵溫度、pH值、轉速和裝液量等發(fā)酵因素處于最佳值的情況下,考察 Streptomyces flaveo-l u s D S M9 9 5 4在發(fā)酵進程中,生物量和SFA產量變化。結果如圖 6所示,在 72 h前,鏈霉菌的 SFA產量很低,在 108 h時菌體生長進入衰亡期,SFA產量達到最高值 6.12 mg·L-1。適當延長衰亡期將有利于進一步提高 SFA發(fā)酵產量。我們還發(fā)現發(fā)酵液的顏色會隨著發(fā)酵時期而變化,從第三天開始由灰色轉變?yōu)辄S綠色,衰亡期伴隨著各種色素產生。從色素的變化可以間接反映 SFA的產生和產量。

圖4 搖床轉速對 SFA生產的影響

圖5 裝液量對 SFA發(fā)酵的影響

圖 6 SFA產量和細胞生長曲線

3 結論

實驗研究發(fā)現,Streptom yces flaveolus發(fā)酵產生 SFA的過程對發(fā)酵條件非常敏感。這可能是很多關于 SFA發(fā)酵報道的產量偏低的重要原因。本文針對種齡、接種量、溫度、pH、搖床轉速和裝液量等發(fā)酵重要參數進行了系統(tǒng)研究。經過條件優(yōu)化,得到最佳發(fā)酵工藝:種齡 24 h、接種量 6%(v/v)、培養(yǎng)溫度 30℃、發(fā)酵液初始 pH 6.5、搖床轉速 300 rpm和裝液量 25 mL/250 mL搖瓶。在最佳的搖瓶發(fā)酵條件下,SFA產量在發(fā)酵 108 h時,達到 6.12 mg·L-1,這是發(fā)酵條件優(yōu)化前 (2.01 mg·L-1)3倍多。比其他報道的 SFA發(fā)酵水平都有明顯的提高。當然,進一步擴大 SFA發(fā)酵規(guī)模,尤其是利用發(fā)酵罐深層培養(yǎng)將可能進一步提高 SFA的發(fā)酵水平。這些工作為推動 SFA大規(guī)模生產和臨床應用提供了重要的實驗基礎。

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