ANCA相關性血管炎存在血管內皮細胞血栓調節蛋白以及內皮源性一氧化氮合酶彌漫性丟失

李穎 漆學良 張巍 王朝霞 馮立群 袁云

ANCA相關性血管炎存在血管內皮細胞血栓調節蛋白以及內皮源性一氧化氮合酶彌漫性丟失

李穎*漆學良※張巍△王朝霞△馮立群*袁云△

目的 探索ANCA相關性血管炎(antineutrophil cytoplasmic antibody－associated vasculitis，AAV)微小動脈和靜脈的血管內皮細胞膜結合性血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)、內皮源性一氧化氮合酶(endothelial－nitric oxide synthase，eNOS)的表達規律。方法 12例經過臨床、血清免疫學檢查證實的AAV患者，2例Wegerner肉芽腫、5例顯微鏡下多血管炎和5例Churg－Strause綜合征。Birmingham血管炎活動評分提示疾病處于活動期。均進行腓腸神經活檢標本的常規組織學染色以及以抗CD68、CD3、CD20、血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)、eNOS以及第八因子(von Willebrand factor，vWF)抗體為第一抗體的免疫組織化學染色，以正常血管為對照。結果 12例患者的腓腸神經病理檢查發現9例活動性血管炎，可見大量CD68陽性單核細胞和CD3陽性淋巴細胞浸潤。和對照組相比，所有患者微小動脈和毛細血管內皮細胞eNOS和TM減低或消失，包括無炎細胞浸潤血管，其中eNOS的下降程度較TM更明顯。Churg－Strause綜合征的血管內皮細胞eNOS和TM下降最顯著。結論 AAV外周血管存在血管內皮細胞TM和eNOS彌漫性下降，兩者下降程度在AAV不同亞型之間存在差異。

抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎 腓腸神經活檢 血栓調節蛋白 內皮源性一氧化氮合酶

抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎(antineutro－ phil cytoplasmic antibody－associated vasculitis，AAV)是一類原發性系統性小血管炎，包括 Wegerner肉芽腫(wegerner granulomatosis，WG)、顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)和 Churg－Strause 綜 合 征(Churg－Strause syndrome，CSS)［1］。病理改變特點是小動脈、微動脈和小靜脈的管壁出現節段性纖維素樣壞死伴隨淋巴－單核細胞浸潤。其診斷主要依靠血管炎臨床癥狀以及血清ANCA陽性，病理檢查發現壞死性血管炎可以進一步確診此病［2］。

內皮源性一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase，eNOS)是血管內皮細胞中一種能夠通過精氨酸合成一氧化氮的酶，而血管內皮細胞膜結合的血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)是抗凝血過程中凝血酶的高親和力受體。TM可以傳遞信號到eNOS調節蛋白偶聯受體，兩者在抗血栓和抗炎過程中發揮重要的作用。血管內皮細胞TM和eNOS減少可以出現在以微血管損害為主的皮肌炎患者［3］，AAV患者外周血管內皮細胞TM和eNOS存在哪些變化還缺乏系統性研究，為此我們對12例經過臨床和血清學證實的AAV患者進行腓腸神經活檢標本的免疫組化研究，以探討腓腸神經滋養血管內皮細胞中TM和eNOS的改變規律。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 本實驗納入2005年5月到2008年12月之間在北京大學第一醫院神經內科就診的12例患者，診斷標準參考1998年日本修訂的WG、CSS以及MPA的診斷標準［4］，其中 WG2例、MPA5例和 CSS5例。男5例、女7例，發病年齡28～75歲，平均(55.3±12.5)歲。所有患者均出現下肢為主的麻木、疼痛，其中肢體無力伴肌萎縮10例，發熱8例，腎臟損害7例，呼吸道癥狀合并關節疼痛5例，視力下降和皮膚損害各3例，副鼻竇炎并聽力下降2例，腹痛為主要表現的消化道癥狀2例，心臟損害1例。Birmingham血管炎活動評分為11～28分。

12 例患者有11例出現血清ANCA抗體陽性，其中MPO陽性5例、可疑陽性2例，PR3和IIF陽性各2例，1例CSS患者為陰性。肌電圖檢查和周圍神經傳導速度檢查均提示存在周圍神經損害。

1.2 研究方法 經過知情同意，對患者進行腓腸神經活檢。腓腸神經標本進行石蠟包埋、切片和下列染色:①常規組織學染色，包括蘇木精－伊紅染色(HE)、LFB－HE染色和剛果紅染色;②免疫組化染色(EnVision二步法)，第一抗體為(血栓調節素)TM、(8因子)vWF抗體、eNOS抗體、CD3抗體、CD20抗體及 CD68抗體。在免疫組織化學染色中血管內皮細胞呈棕黃色反應為陽性，根據染色強度分3級，陰性為血管內膜無著色，弱陽性為輕度或部分著色，陽性為明顯均勻的著色。非血管炎腓腸神經標本對照組也進行 vWF、eNOS、TM的免疫組織化學染色。

2 結果

12 例患者中9例神經外衣可見活動性血管炎，受累血管直徑主要在20～438μm之間。9例患者小動脈出現血管內膜肥厚和纖維素樣壞死，血管中層平滑肌細胞間及血管外膜大量單核細胞和淋巴細胞浸潤(圖1)，每例患者都可以看到個別血管僅出現血管內膜或外膜炎細胞浸潤，7例觀察到小血管內膜纖維性增生及新生血管再通現象。9例患者微動脈出現內膜增生和管腔閉塞，在血管壁及周圍出現炎細胞浸潤。許多小靜脈周圍也可看到不同程度炎細胞浸潤。有3例患者未發現明顯血管炎性改變。12例患者均出現神經束內毛細血管增生以及內皮細胞肥大。12例患者均出現中到重度軸索性周圍神經病病理改變，可見不同程度有髓神經纖維丟失。

免疫組織化學染色顯示9例患者血管壁及周圍出現CD68陽性單核細胞和CD3陽性T淋巴細胞浸潤，3例患者血管周圍可見少量CD20陽性B淋巴細胞浸潤。此外，CD68陽性單核細胞出現在所有患者的神經束內、神經束衣、神經外衣，并可見泡沫細胞形成。

患者和正常對照的毛細血管以及微小血管內皮細胞vWF均呈陽性表達。所有患者不同直徑的微小動脈和靜脈以及毛細血管，包括沒有出現血管炎性損害的血管，均出現內皮細胞eNOS表達下降(圖2b)。6例eNOS表達為陰性，其中4例為CSS，2例為MPA患者。對照組的血管內皮細胞eNOS均陽性(圖2a)。所有患者不同直徑的微小動脈和靜脈血管及毛細血管均出現內皮細胞TM表達下降，包括無血管炎改變的血管(圖3a)，其中3例為陰性，均為CSS患者。對照組血管內皮細胞TM為陽性(圖3b)。

3 討論

腓腸神經的滋養血管為小動脈和微動脈，是AAV最易累及的血管［5］。本組患者出現感覺神經損害為主的周圍神經病，提示腓腸神經的滋養血管被累及，Birmingham血管炎活動評分提示疾病處于活動期，研究這些血管可以反映AAV的血管病變規律。

病理檢查可以發現部分血管存在炎細胞浸潤，而部分血管組織學檢查無明顯異常。我們發現AAV各亞型在炎性活動期血管內皮的eNOS表達顯著下降甚至完全喪失，在相對完整的微小動脈及毛細血管內皮也出現表達下降。文獻報告類似的改變也出現在AAV的腎小球的毛細血管［6］，提示血管內皮細胞損傷非常廣泛［3］。我們發現AAV亞型中CSS的血管改變最顯著，而MPA和WG的血管內皮細胞還存在部分eNOS陽性表達，說明eNOS表達下降在不同的亞型之間存在差異。

表1 12例AAV患者的臨床癥狀總結

圖1 小動脈內膜纖維素樣壞死，中層平滑肌炎細胞浸潤(例1，HE染色400×)圖2A 血管內皮細胞eNOS正常陽性表達(對照1，En Vision二步法400×)圖2B 血管內皮細胞eNOS無陽性表達(例8，En Vision二步法400×)圖3A 血管內皮細胞TM正常陽性表達(對照1，En Vision二步法400×)圖3B 血管內皮細胞TM無陽性表達(例11，En Vision二步法400×)

Heeringa P等［6］在WG患者的研究中發現腎小球毛細血管eNOS丟失伴隨內皮細胞CD31丟失，認為與局部炎細胞浸潤導致內皮細胞損傷有關。我們發現許多血管的內皮細胞vWF染色正常，提示這些血管的內皮細胞還存在，特別是在非炎細胞浸潤的血管，盡管有血管內皮細胞eNOS脫失，但顯然不能單純歸結于局部炎細胞對內皮細胞的直接損害。我們推測血管炎出現的多種炎性細胞因子增加［7－8］是導致彌漫性血管內皮細胞eNOS的脫失的主要原因之一，因腫瘤壞死因子以及脂多糖物質可以在mRNA水平、蛋白表達穩定以及二聚化方面下調eNOS表達［9］，導致體外培養的血管內皮細胞eNOS下降。最近發現eNOS的基因多態性與閉塞性血管炎的發生有關［10］，AAV也存在eNOS的基因多態性，不排除在發病前已存在eNOS下降的可能性。

在不同類型AAV中，血管內皮細胞膜結合的TM在血管內皮細胞呈彌漫性脫失，與eNOS具有類似的規律，但下降程度比eNOS小，在不同的AAV患者中TM下降程度存在很大差異。AAV血液內TM的增加［11］可能與內皮細胞膜結合的TM脫失有關，而TM脫失也可能和eNOS下降一樣，和血液內各種炎性因子增加有關，特別是腫瘤壞死因子［12］。高劑量的地塞米松可以下調TM的表達［13］，使血管內皮細胞膜結合的TM減少，進一步加重TM的抗血栓、抗炎和抗凋亡功能障礙。

總之，AAV血管炎癥細胞浸潤具有節段性，但血管內皮細胞的損傷具有彌漫性的特點，這種改變在不同類型AAV之間存在差異，其減少可能不是炎細胞的直接作用。在治療AAV的過程中應當給予抗血栓治療。

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Diffuse reduction of endothelial-nitric oxide synthase and thrombomodulin in vascular endothelium in patients with ANCA.

LIYing，QIXueliang，ZHANGWei，WANG Zhaoxia，FENG Liqun，YUAN Yun.Department of Neurology，Beijing University First Hospital，Beijing，100034，China，Tel:010 －83572588.

ObjectiveTo investigate the expression features of endothelial－nitric oxide synthase and thrombomodulin in vascular endothelium of the arteriolar and venule wall in patients with ANCA associated vasculitis.MethodsWe collected 12 patientswith ANCA associated vasculitis confirmed by clinical and serum immunological diagnosis，including 2 cases ofWegerner granulomatosis，5 cases ofmicroscopic polyangiitis and 5 cases of Churg－Strause syndrome.Sural nerve biopsiesweremade in all patients.The specimens were stained with routine histological and immunohistological stainings with first antibodies aganist CD 68，CD 20，CD 4，von Willebrand Factor，the endothelial－nitric oxide synthase(eNOS)and the thrombomodulin(TM).ResultsNine of 12 patients with active vasculitis had numerous CD68 positive macrophage and CD3 positive T－lymphocytes infiltrating.Compared with the normal control，the expression of eNOSand TM were significantly decreased or totally disappeared in the vascular endothelium of capillaries，arterioles and venuels，including the vessel without inflammatory infiltrating.The reduction in eNOSand TM expression weremore obvious in Churg－Strause syndrome among three types of AAV.The decrease in eNOSexpression wasmore profound than TM.ConclusionThere is diffuse reduction of eNOS and TM expression in vascular endothelium in patients with AAV and the reduction varies among three types of AAV.

Antineutrophil cytoplasmic antibody－associated vasculitis Sural nerve biopsy Endothelial－nitric oxide synthase Thrombomodulin

※南昌大學第二附屬醫院神經內科

R593.2

A

* 首都醫科大學附屬北京安貞醫院神經內科(北京 100029)

E－mail:yuanyun2002@sohu.com)

△北京大學第一醫院神經內科

2010－11－18)

(責任編輯:李 立)

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