光剝奪導致大鼠抑郁樣改變及其機制研究

王為 趙廣宇 劉煜 李柱一 宿長軍

光剝奪導致大鼠抑郁樣改變及其機制研究

王為*趙廣宇*劉煜*李柱一*宿長軍*

目的 探討長時間光剝奪是否導致大鼠的抑郁樣改變，并從中樞甘丙肽水平和神經元凋亡角度探討可能的病理機制。方法 隨機選取實驗組及對照組大鼠各12只，分別經持續避光及正常光照條件下飼養6周后，以強迫游泳實驗中的靜止時間判定大鼠的抑郁表現，以免疫熒光染色法檢測大鼠腦部的甘丙肽水平及神經元凋亡情況。結果 光剝奪組大鼠體重增加量及日均攝食量均低于光照組［(239.23±30.88)g vs(310.85±30.59)g，P＜0.01;(31.25±2.10)g vs(39.55±1.51)g，P＜0.01］，在強迫游泳實驗中的靜止不動時間較光照組延長［(135.81±8.84)s vs(56.33±7.26)s，P＜0.05］，而中縫背核和藍斑處的甘丙肽水平(以積分光密度表示)降低［(37.23±3.77)vs(29.25±2.95)，P＜0.05;(19.52±0.72)vs(5.13±2.68)，P＜0.01］，但并未觀察到神經元凋亡。結論 長時間光剝奪可導致大鼠出現抑郁樣表現，中樞甘丙肽水平的降低可能參與了這一過程。

抑郁 甘丙肽 光剝奪

目前對于抑郁癥的非藥物治療有光照療法等數種方式［1］，而在一種特定類型的抑郁癥－季節性情感障礙(Seasonal Affective Disorder，SAD)中，疾病的發生發展隨著不同季節中光照節律的變化而變化［2］。因此，光照改變導致的晝夜節律改變可能與抑郁癥的發生發展有一定聯系，但二者的關系仍須進一步明確且相關機制仍不清。有研究顯示，光剝奪后大鼠中樞神經系統的藍斑去甲腎上腺素神經元等單胺能神經元有凋亡現象［3］;而抑郁癥的發生發展與中樞神經系統的多種神經遞質密切相關，其中近年的研究已顯示中樞甘丙肽(Galanin)水平的異?？赡芘c抑郁癥相關［4－6］，甘丙肽在中樞分布最豐富的區域正是藍斑等腦區［4］。為此本研究擬建立大鼠的光剝奪模型，并從藍斑等腦區中樞甘丙肽水平的變化和神經元凋亡兩方面來探討大鼠抑郁的可能機制，為抑郁癥的病因機制探索積累科學資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及光剝奪模型的建立 體重150 g～180 g雄性SD大鼠24只，隨機分為光剝奪組和光照組各12只。前者始終置于暗室;后者置于正常光照房間，照明時間為8:00～18:00。各組每個鼠籠內飼養2只大鼠，鼠籠集中并列放置以盡量保持實驗條件一致。每2～3天添加食水，每4～6天更換墊料，共飼養6周。各項日常操作，光剝奪組在弱紅光照明條件下迅速進行。為消除行為學實驗中體重、體能等方面的差異可能對大鼠單純運動能力帶來的影響，另設置光照－2組大鼠6只。光照－2組飼養條件同光照組，但飼養時間縮短為4～5周，以保持與光剝奪組相同的體重。

1.2 強迫游泳實驗 模型建立后，光剝奪組及光照組各隨機選取6只大鼠，另選光照－2組6只大鼠，進行強迫游泳實驗檢驗大鼠的抑郁狀態。選用直徑40 cm×高70 cm透明樹脂圓形水槽，水深40 cm，水溫28～30℃。實驗首日每只大鼠適應性游泳15 min。次日正式實驗，每只大鼠游泳5 min，并全程錄像。參考既往相關研究［7］，將大鼠的活動分為三類:靜止不動行為，即大鼠漂浮無動作或除了為避免沒入水中而劃水外再無其他行為;掙扎和攀爬行為，即大鼠持續用力沿水槽內壁向上攀爬，試圖擺脫水環境;游泳和下潛行為，即大鼠在水槽內四周游動或主動下潛。由未參與此研究的兩名實驗員判讀實驗錄像，記錄“靜止不動行為”的總時間作為“靜止時間”。

1.3 大鼠中樞甘丙肽水平及神經元凋亡的檢測 均采用免疫熒光染色法。模型建立后，光剝奪組及光照組各選取6只未參加強迫游泳實驗的大鼠，進行免疫熒光染色，觀察甘丙肽水平的變化及相關部位神經元凋亡情況。大鼠經常規灌注固定后取腦，冰凍切片機連續冠狀切片，片厚30μm。選取中縫背核、藍斑處切片，以0.3%Triton X－100處理30 min后分別入一抗:甘丙肽 H－80(Santa Cruz;1∶500)、抗－聚二磷酸腺苷核糖聚合酶p85片段(poly ADP－ribose polymerase p85，PARP p85)抗體(Promega;1∶500)，4 ℃孵育 24 h。二抗選用Alexa Fluor594驢抗兔IgG(Invitrogen;1∶500)，室溫孵育3 h。貼片封片后于熒光顯微鏡下觀察采圖。

觀察神經元凋亡時，取體重250～300 g雄性SD大鼠6只，采取線栓法制備大腦中動脈缺血－再灌注(middle cerebral artery occlusion/ischemic reperfusion，MCAO/IR)模型［8］作為陽性對照。模型建立24 h后，將大鼠常規灌注固定并取腦切片，切片部位廣泛選取，包括藍斑、中縫背核、皮層、下丘腦等。染色方法同前。

在針對甘丙肽的免疫熒光染色中，選取相同放大倍數、相同曝光時間的圖片，采用Image－Pro Plus軟件進行分析。分別在各圖片的中縫背核、藍斑對應處選取等大的測量區域，統計該區域內的積分光密度(integral optical density，IOD)。

1.4 數據統計處理 所有數據采用SPSS 16.0分析。結果均以均值±標準差(ˉx±s)表示。兩組間比較采用兩樣本的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較采用 SNK(Student－Newman－Keuls)檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 大鼠體重、攝食量的比較 經6周避光飼養后，光剝奪組大鼠體重增加量明顯小于光照組(t=5.71，P＜0.01)。同時，光剝奪組大鼠第5～6周期間的日均攝食量明顯低于光照組(t=11.09，P＜0.01)。見表1。

2.2 強迫游泳靜止不動時間的比較 進行強迫游泳試驗的光剝奪組、光照組、光照－2組大鼠各6只，3組的體重有明顯差異(F=8.40，P＜0.01)。其中，光剝奪組與光照－2組體重均低于光照組(q=4.31，P＜0.05;q=5.30，P＜0.05)，但二者無明顯差異(q=1.79，P＞0.05)。3組強迫游泳的靜止時間差異有統計學意義(F=202.07，P＜0.01)，其中光剝奪組的靜止時間明顯長于光照組(q=25.23，P＜0.05)及光照－2組(q=23.96，P＜0.05)，而后兩者間的差異無統計學意義(q=1.27，P＞0.05)。見表1。

2.3 中樞甘丙肽水平和神經元凋亡情況的比較 與光照組比較，光剝奪組大鼠中縫背核、藍斑處甘丙肽熒光強度均明顯減弱(t=3.59，P＜0.05;t=14.82，P＜0.01)。見圖1和表1。在光剝奪組及光照組大鼠腦內(包括中縫背核和藍斑)均無提示神經元凋亡的PARP p85陽性細胞出現。而在作為陽性對照的MCAO/IR模型大鼠多個腦區域發現大量PARP p85陽性細胞，在皮層處尤為明顯。見圖2。

表1 各組大鼠體重增加量、日均攝食量、強迫游泳實驗靜止時間和中樞甘丙肽水平的比較

圖1 免疫熒光顯示大鼠中樞甘丙肽水平變化情況。圖A、C示光剝奪組大鼠中縫背核和藍斑甘丙肽表達情況;圖B、D示光照組大鼠中縫背核和藍斑甘丙肽表達情況。Aq:大腦水管;DR:中縫背核;4V:第四腦室;LC:藍斑

圖2 長期光剝奪大鼠中縫背核和藍斑內未見凋亡神經元出現。圖A～D示光剝奪組大鼠(A，C)和光照組大鼠(B，D)中縫背核(A，B)和藍斑內(C，D)內均未見凋亡神經元。圖E示MCAO/IR模型組大鼠大腦皮層內出現大量凋亡的神經元。Aq:大腦水管;DR:中縫背核;4V:第四腦室;LC:藍斑

3 討論

在美國的精神障礙診斷與統計手冊第4版中，SAD已不再被單獨列為一種情感障礙，而是重性抑郁障礙(Major Depressive Episode)的一種特殊類型。這一分類，反映了SAD與抑郁癥之間的密切聯系，也提示了利用光剝奪方法進行研究，很可能對認識更多類型抑郁癥的發病機理提供幫助。本研究通過模仿SAD發生發展中的重要因素－低光照，建立了大鼠的光剝奪模型，觀察了光剝奪后大鼠抑郁程度以及其中樞神經系統內甘丙肽水平的變化。結果顯示，經過6周光剝奪，大鼠的攝食量和體重增加量均明顯低于對照組，且在校正體重差異帶來的影響后，其在強迫游泳實驗中的靜止時間明顯延長。結合抑郁癥患者通常出現飲食減少、體重減輕的癥狀，并參考慢性非預見性應激抑郁模型大鼠在強迫游泳實驗中的表現［9］，可以認為，光剝奪6周后的大鼠出現了抑郁樣表現。

本研究結果顯示，與正常光照組比較，光剝奪組大鼠還出現了中縫背核、藍斑處甘丙肽水平的降低。中縫背核、藍斑是中樞神經系統內甘丙肽表達最為豐富的區域［10］，這些位置甘丙肽水平的變化可反映整個中樞甘丙肽水平的變化。研究表明，中樞神經系統內的甘丙肽標記物通常與膽堿能、兒茶酚胺能、5－羥色胺能的標記物共存。尤其值得注意的是:在中縫背核處，大多數色氨酸羥化酶陽性的神經元都會同時表達中等程度的甘丙肽［11］，前者是5－羥色胺合成的限速酶;與此類似，藍斑處的甘丙肽與多巴胺β－羥化酶的標記物幾乎呈完全共存［11］，后者是去甲腎上腺素能神經元的重要標記物。抑郁癥的發生發展與多種神經遞質的異常有關，其中就包括5－羥色胺以及去甲腎上腺素等單胺類遞質［12－13］，而甘丙肽可能正是通過與這些遞質及其受體的相互作用，參與了抑郁癥的發生發展［4，14］。此前的研究發現，光剝奪可以導致中樞神經系統單胺類遞質的水平下降［3］，而本研究更進一步明確了光剝奪后甘丙肽水平的下降。結合上述結果，可推測光剝奪可能通過影響了包括甘丙肽在內的多種神經遞質的水平，導致了抑郁狀態的發生。

Gonzalez等［3］的研究顯示光剝奪導致了藍斑去甲腎上腺素能神經元等單胺能神經元處于“凋亡過程中的初級階段”，其結論是依據PARP p85免疫熒光染色的圖片。細胞發生凋亡時，PARP被酶切為分子量85kDa(即PARP p85)和25kDa的兩個片段，從而喪失其DNA修復功能，因此PARP p85的水平上升可用來反映凋亡發生情況［15］。參照該論文［3］的圖片，本研究偶見類似的PARP p85弱陽性細胞，但數量極少且熒光強度很弱，很難與背底染色區別;同時在光剝奪組和光照組均有發現，分布區域也不局限于中縫背核、藍斑處。因此，提示PARP p85弱陽性細胞并不能反映出神經元處于凋亡前期狀態，光剝奪后是否存在神經元凋亡有待進一步探討。同時，提示本研究觀察到光剝奪后大鼠中縫背核、藍斑處甘丙肽水平的下降并非由神經元凋亡引起，其具體原因有待進一步研究。

本研究成功建立了大鼠的光剝奪模型，進一步證實了甘丙肽與抑郁癥之間可能存在聯系，為了解SAD以及其它類型抑郁癥的發生發展提供了新的思路。但是，甘丙肽只是中樞諸多遞質中的一種，光剝奪是否還影響了其它遞質、遞質水平變化的具體機制仍有待進一步研究。

［1］ Even C，Schr?der CM，Friedman S，et al.Efficacy of light therapy in nonseasonal depression:a systematic review［J］.J Affect Disord，2008，108(1－2):11－23.

［2］ Lam RW，Levitan RD.Pathophysiology of seasonal affective disorder:a review［J］.J Psychiatry Neurosci，2000，25(5):469 －480.

［3］ Gonzalez MM，Aston－Jones G.Light deprivation damages monoamine neurons and produces a depressive behavioral phenotype in rats［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(12):4898 －4903.

［4］ Kuteeva E，H?kfelt T，Wardi T，et al.Galanin，galanin receptor subtypes and depression－like behavior［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(12):1854 －1863.

［5］ Karlsson RM，Holmes A.Galanin as amodulator of anxiety and depression and a therapeutic target for affective disease［J］.Amino Acids，2006，31(3):231 －239.

［6］ Kuteeva E，Wardi T，Lundstr?m L，etal.Differential role ofgalanin receptors in the regulation of depression－like behavior and monoamine/stress－related genes at the cell body level［J］.Neuropsychopharmacology，2008，33(11):2573 －2585.

［7］ Cryan JF，Valentino RJ，Lucki I.Assessing substrates underlying the behavioral effects of antidepressants using the modified rat forced swimming test［J］.Neurosci Biobehav Rev，2005，29(4 －5):547－569.

［8］ Ajmo CT，Collier LA，Leonardo CC，et al.Blockade of adrenoreceptors inhibits the splenic response to stroke［J］.Exp Neurol，2009，218(1):47 －55.

［9］ 劉紀猛，李恒芬，謝正.抑郁模型大鼠中樞G蛋白的研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2009，35(2):108－110.

［10］ Lang R，Gundlach AL，Kofler B.The galanin peptide family:receptor pharmacology，pleiotropic biological actions，and implications in health and disease［J］.Pharmacol Ther，2007，115(2):177－207.

［11］ Lu X，Barr AM，Kinney JW，et al.A role of galanin in antidepressant actionswith a focus on the dorsal raphe nucleus［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2005，102(3):874－879.

［12］ Zhao Z，Zhang HT，Bootzin E，et al.Association of changes in norepinephrine and serotonin transporter expression with the longterm behavioral effects of antidepressant drugs［J］.Neuropsychopharmacology，2009，34(6):1467 －1481.

［13］ Perona MT，Waters S，Hall FS，et al.Animalmodels of depression in dopamine， serotonin， and norepinephrine transporter knockoutmice:prominenteffectsof dopamine transporter deletions［J］.Behav Pharmacol，2008，19(5 －6):566 －574.

［14］ Ogren SO，Razani H，Elvander－Tottie E，et al.The neuropeptide galanin as an in vivomodulator of brain 5－HT1A receptors:possible relevance for affective disorders［J］.Physiol Behav，2007，92(1－2):172－179.

［15］ Ertsey R，Chapin CJ，Kitterman JA，et al.Ontogeny of poly(ADP－ribose)polymerase－1 in lung and developmental implications［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，2004，30(6):853 － 861.

Effect of long-tim e light dep rivation on depression and the possible pathologicalmechanism.

WANGWei，ZHAO Guangyu，LIU Yu，LIZhuyi，SU Changjun.Department of Neurology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，17West Changle Road，Xian 710032.China.Tel:029 －84777743.

ObjectiveTo investigate the impact of long－time light deprivation on depression－like behavior，and probe into the possible pathologicalmechanism with focus on central galanin level and apoptosis.MethodsTwelve rats were kept in constant darkness for 6 weeks and 12 rats housed in a normal light－dark schedule served as controls.The immobility time in forced swim test(FST)was used to determine the extent of depression and immunofluorescence staining was employed to examine galanin expression aswell as apoptotic neurons in the ratbrain.ResultsRats from the light deprivation group showed a decrease in both body－weightgain and food－intake compared with control rats ［(239.23 ±30.88)g vs(310.85±30.59)g，P＜0.01;(31.25±2.10)g vs(39.55±1.51)g，P＜0.01］.FST data showed that rats treated with 6 week－light deprivation showed a longer immobility time compared with controls ［(135.81 ±8.84)s vs(56.33 ±7.26)s，P＜ 0.05］.Immunofluorescence staining detected a reduction of galanin level，as evidenced by integral optical density，in the dorsal raphe nucleus and locus coeruleus［(37.23±3.77)vs(29.25±2.95)，P＜0.05;(19.52±0.72)vs(5.13 ±2.68)，P＜0.01］，but not detect any apoptotic cell in the brain of rats treated with 6 week－light deprivation.ConclusionLong－time light deprivation leads to depression－like behavior in rats.The down－regulation of galanin level in the rat brainmay be involved in long－time light deprivation－induced depression－like behavior.

Depression Galanin Light deprivation

R749.4

A

☆國家自然科學基金資助項目(編號:30970945)，“973”課題資助項目(編號:2007CB512303)

* 第四軍醫大學唐都醫院神經科(西安 710032)

(E－mail tdneurob@fmmu.edu.cn)

2010－10－22)

(責任編輯:曹莉萍)

·會訊·