米托蒽醌聯合順鉑對腦膠質瘤U87細胞株的影響

周紅建 王雄偉 劉朝奇 覃曉琳 孫儷 汪雷 王旭光

米托蒽醌聯合順鉑對腦膠質瘤U87細胞株的影響

周紅建*王雄偉*劉朝奇△覃曉琳△孫儷△汪雷*王旭光*

目的 體外觀察米托蒽醌(mitoxantrone，NVT)聯合順鉑(cisplatin，CDDP)對腦膠質瘤U87細胞株的增殖抑制作用及可能的協同機制。方法 MTT法檢測濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL NVT、CDDP以及兩藥物聯合對U87細胞的增殖抑制作用。RT-PCR法檢測CDDP、NVT及兩藥聯合對U87細胞上Bcl-2和Bax基因表達的影響。結果 MTT法檢測結果顯示，NVT濃度為0.3125μg/mL聯合相同濃度CDDP時，兩藥聯合能明顯增強其對U87細胞的增殖抑制作用(67.7% ±1.5%);RT-PCR法檢測顯示，CDDP組Bax基因的表達明顯高于正常對照組，但對Bcl-2基因無此作用;低濃度的NVT和兩藥聯合Bcl-2基因的表達明顯低于正常對照組及順鉑組。結論 膠質瘤U87細胞在化療藥物NVT和CDDP兩藥物聯合作用下可通過誘導Bcl-2/Bax基因表達量的改變，協同發揮其促凋亡作用，從而增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

腦膠質瘤 聯合 Bcl-2/Bax 米托蒽醌 順鉑

膠質瘤約占顱內原發腫瘤的40%～50%［1］。在美國，2005年就有1.85萬新增惡性原發性神經系統腫瘤患者［2］。目前對神經膠質瘤的化療傾向于聯合用藥，根據細胞動力學和藥物對細胞周期的特異性，用兩種以上藥物，甚至多種藥物聯合應用以提高療效。目前有許多聯合用藥方案，如伊立替康和卡莫司汀聯合、丙卡巴腆與長春新堿和洛莫司汀聯合、埃羅替尼、吉非替尼和貝伐單抗聯合伊立替康等治療策略［3］已經在進行或完成了相關臨床研究，并取得良好效果。本研究主要探討米托蒽醌(mitoxantrone，NVT)聯合順鉑(cisplatin，CDDP)是否可以增強對U87細胞的抑制作用，以期改善化療藥物對預防腦膠質瘤術后復發的效果。通過觀察用藥前后U87細胞上Bcl-2或Bax基因的變化，對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象 腦膠質瘤細胞株U87由同濟醫學院神經外科實驗室惠贈。RPMI1640、胎牛血清購于美國Sigma公司產品。米托蒽醌購自山東羅欣藥業股份有限公司，順鉑購自齊魯制藥有限公司，MTT細胞增殖分析試劑為Promega公司產品。PCR儀為美國Bio-Rad公司產品。全波長酶標儀為Thermo公司產品。

1.2 細胞培養與試劑配置 U87細胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，2～3 d更換1次培養液，待細胞融合達80%時即消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。CDDP和NVT均用PBS配制成1mg/mL的儲存液，放置于－20℃冰箱保存，使用時稀釋至相應終濃度。

1.3 MTT法檢測細胞的增殖抑制率 取對數生長期細胞，以1.5×104個/mL的細胞密度接種于96孔板中，100μL/孔。按 Chou-Talalay 聯合指數法［4］實驗設計一般原則，分組如下:CDDP組分別按 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL共6個濃度梯度給藥;NVT組分別按 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL 共 6個濃度梯度給藥;聯合用藥組中CDDP、NVT濃度分別為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL，按 2 藥相同濃度間進行兩兩組合。每個濃度設3個復孔，共設置細胞對照組(不加藥物)、CDDP組、NVT組和聯合藥物組。待藥物作用48 h后終止培養。加入MTT溶液(5 mg/mL)100μL/孔，繼續培養4 h后終止培養，去上清，加入 DMSO 100μL/孔，水平緩慢振蕩 10～15 min使晶體充分溶解，用酶標儀在波長490 nm處讀取各孔吸光度(OD)值。按以下公式計算各組細胞的增殖抑制率(inhibition rate，IR)。IR=(1－OD實驗孔/OD對照孔)×100%。按金正均提出的概率和法計算Q值并判斷2藥的協同作用［5］。Q=E(A+B)/［EA+(1－EA)×EB］，其中E(A+B)為兩藥聯合應用時的細胞增殖抑制率，EA和EB分別為兩藥單獨應用時的細胞增殖抑制率。當Q為0.85～1.15時，表示兩藥作用相加;當Q＞1.15時，表示兩藥作用協同;當Q＜0.85時，表示兩藥相互拮抗。

1.4 RT-PCR法檢測細胞上Bcl-2和Bax基因的表達 分別收集經藥物處理48 h和未經藥物處理的U87細胞株，總RNA提取和RT-PCR分別按相應試劑盒說明書進行。PCR引物 Bcl-2:上游 5'-TCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'，下 游 5'-CAGAGTCTTCAGAGACAGCCAGGA-3'，產物 176 bp;Bax:上游 5'-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3'，下 游 5'-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3'，產物 165 bp;β-actin 為內參照，上游引物為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA－3'，下游引物為 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，產物 186 bp。用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠掃描儀下掃描結果并進行灰度分析。

1.5 統計學方法應用SPSS 13.0進行分析，以ˉx±s表示。同一藥物不同濃度組間采用單因素方差分析進行比較，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗進行分析，α=0.05。

2 結果

2.1 細胞的增殖抑制率 NVT單藥各濃度間細胞的增殖抑制率差異有統計學意義(F=39.125，P＜0.01);CDDP組對U87細胞的增殖有明顯的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，其對U87細胞的增殖抑制作用逐漸增強(F=21.986，P＜0.01);聯合用藥組對U87細胞的增殖有也具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，其對U87細胞的增殖抑制作用逐漸增強(F=39.286，P＜0.01);當NVT聯合相應濃度CDDP時，聯合用藥組與相應濃度NVT、CDDP單藥組比較，其細胞的增殖抑制率明顯提高，兩組間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 聯合用藥協同作用判斷結果 按上述計算Q值:當米托蒽醌濃度為0.625μg/mL、0.3125μg/mL，與相應濃度的順鉑聯合應用時，其Q值分別為1.17和1.64，表示兩藥間聯合具有協同作用(Q＞1.15);當米托蒽醌濃度為 1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL，與相應濃度的順鉑聯合應用時，則表示相加作用(Q值為0.85～1.15)。

2.3 細胞形態變化 順鉑濃度為0.3125μg/mL、米托蒽醌濃度為0.3125μg/mL及兩藥聯合組處理后鏡下細胞形態變化。見圖1。

表1 NVT和CDDP作用48h時膠質瘤U87細胞的增殖抑制率

圖1 倒置相差顯微鏡下細胞形態(100×)。A:正常細胞組;B:順鉑組(0.3125μg/mL);C:米托蒽醌組(0.3125μg/mL);D:聯合組:(0.3125 μg/mL)

2.4 RT-PCR法檢測U87細胞上Bcl-2和Bax基因的表達 檢測膠質瘤U87細胞經藥物處理和未經藥物處理48h后Bcl-2和Bax基因mRNA表達的變化，以β-actin為內參照，經過密度掃描和灰度分析發現:Bax基因未經化療藥物時，其在U87細胞表達不明顯，而當CDDP處理后Bax的mRNA表達水平顯著高于正常對照組。Bcl-2基因在未經藥物處理和經順鉑處理后均呈高表達，當NVT或兩藥聯合處理后可下調Bcl-2的mRNA表達。見圖2。

圖2 RT-PCR檢測Bcl-2和Bax基因在U87細胞中的表達。PBS:正常對照組;CDDP:順鉑組(終濃度為0.3125μg/mL);NVT:米托蒽醌組(終濃度為0.3125μg/mL);C+N:順鉑聯合米托蒽醌(終濃度為0.3125μg/mL)

3 討論

膠質瘤具有侵襲性和易復發的特點，多為惡性［6］。化療是預防惡性膠質瘤術后復發的關鍵。米托蒽醌是細胞周期非特異性廣譜抗癌藥，作用機制主要是抑制DNA合成，它可與堿基強有力地結合而嵌入DNA，引起DNA鏈間和鏈內交叉連結，導致單鏈與雙鏈斷裂;其次NVT對RNA聚合酶亦有抑制作用。NVT可殺滅任何細胞周期的腫瘤細胞，使增殖與非增殖細胞均受到抑制，但對S2期細胞最為敏感。順鉑是臨床治療各種惡性腫瘤常用的一線化療藥物，抗癌作用強，抗癌活性高，易與其他抗癌藥配伍，且少有交叉耐藥性，有利于臨床的聯合用藥。然而，對于部分惡性膠質瘤患者，在單用CDDP或NVT化療后，療效不甚滿意，且仍具有較高的復發風險。因此，尋找能夠增強CDDP對膠質瘤細胞殺傷作用的方法，對預防術后復發和改善患者生存具有積極的意義。

細胞凋亡是生物體發育過程中普遍存在的，是一個由基因決定的細胞主動的有序的死亡方式［7］。Bcl-2是抑制凋亡基因，位于18q21上，約230 kb，含有3個外顯子和2個啟動子，其編碼產物位于線粒體內膜上，主要存在于造血細胞、神經元的線粒體膜、細胞核膜和內質網中。Bax為重要的促細胞凋亡基因之一，與Bcl-2有21%的同源性，有對抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，Bcl-2＞Bax，細胞趨于存活;Bax＞Bcl-2，細胞趨于凋亡［8］。多數學者認為，惡性膠質瘤術后腫瘤復發的主要原因之一是腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥，但是目前關膠質瘤細胞對化療藥物的耐藥機制仍不明確。有關腫瘤細胞耐藥的眾多研究認為，Bcl-2基因的表達可引起膠質瘤細胞對化療藥物治療不敏感［9］。此外，王天路等［10］研究發現:下調Bcl-2基因表達可有效抑制神經膠質瘤細胞生長，降低細胞增殖和侵襲能力。

本研究發現，單用米托蒽醌或順鉑對膠質瘤U87細胞株的生長抑制及誘導凋亡作用顯著，當米托蒽醌與順鉑聯合應用時，能明顯增強對U87細胞的增殖抑制作用，特別是在低濃度(≤0.625μg/mL)米托蒽醌時，這種協同作用更為明顯。通過檢測U87細胞用藥后Bcl-2或Bax基因表達量的改變，米托蒽醌和聯合藥物組則可能通過下調Bcl-2基因的表達，從而使Bax＞Bcl-2，減弱其抑制細胞凋亡作用，增強化療藥物抗腫瘤活性的作用;順鉑可上調Bax基因的表達，從而使Bax＞Bcl-2，發揮其促進細胞的凋亡，從而增強化療藥物的抗腫瘤作用。當然，這僅僅是對米托蒽醌、順鉑作用機制初步的探討，今后還需開展進一步的實驗，諸如檢測與靶DNA結合能力的改變以及眾靶基因及相關蛋白表達水平的變化等。

綜上所述，在體外環境下米托蒽醌聯合順鉑能增強對腦膠質瘤U87細胞的增殖抑制作用。當CDDP、NVT藥物相應濃度分別≤0.625μg/mL聯合用藥時，兩藥存在明顯的協同抑制作用(Q值＞1.15)。這不僅可以減少化療藥物的應用劑量，而且在一定程度上減輕了化療藥物對周圍正常腦細胞的殺傷作用。化療藥物對膠質瘤細胞敏感性的高低，對膠質瘤患者臨床個體化化療效果有預見價值，可以幫助臨床醫生選擇有效的化療藥物，設計合理有效的治療方案，避免無效藥物所致的不良反應，提高治療效果。

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Effect of the combination of nitoxantrone and cisplatin on glioma cell line U87.

ZHOU Hongjian，WANGXiongwei，LIU Chaoqi，QIN Xiaolin，SUN Li，WANG Lei，WANG Xuguang.First Clinical Medical College＆Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital;Institute of Molecular Biology，Three Gorges University，Yichang 443002.China.Tel:0717－6483495.

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of the combination ofmitoxantrone(NVT)and cisplatin(CDDP)on the proliferation of U87 glioma cells in vitro.M ethods Different concentrations of NVT(0.31，0.63，1.25，2.5，5 or 10)with or without same concentrations of CDDP were administered to U87 cell cultures and MTT assay was used to detect the proliferation of U87 cell proliferation.RT-PCR was used to detect Bcl-2 and Bax gene expression.Results MTT assay showed that NVT at concentration 0.3125μg/mLwith the same concentration of CDDP could significantly inhibit the proliferation of U87 cells(67.7±1.5).Bax but not Bcl-2 gene expression was significantly higher in CDDP group than in normal control group while Bcl-2 gene expression was significantly lower in both NVT low concentration and the combination groups compared with either control or CDDP alone groups.Conclusions U87 glioma cells in the NVT and CDDP chemotherapy combined effect of two drugs can induce the Bcl-2/Bax gene expression changes，collaborative play its role in inducing apoptosis，thereby enhancing tumor cell sensitivity to chemotherapeutic drugs.

Glioma Combination Bcl-2/Bax gene Mitoxantrone Cisplatin

R651

A

* 三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院(宜昌443002)

E-mail:Wangxiongwei11@yahoo.com.cn)

△三峽大學分子生物所

2010－11－01)

(責任編輯:甘章平)

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