PI3K、AKT和m TOR在侵襲性垂體腺瘤中的表達

賀學農 霍鋼唐茂源 馮清林

PI3K、AKT和m TOR在侵襲性垂體腺瘤中的表達

賀學農*霍鋼△唐茂源△馮清林△

目的 研究磷酯酰肌醇－3－激酶(phosphatid－ylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱AKT)和哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin，mTOR)在侵襲性垂體腺瘤中的表達，探討其與垂體腺瘤侵襲性的關系。方法 61例垂體腺瘤分為侵襲性和非侵襲性兩組，采用免疫組織化學技術檢測PI3K、AKT及mTOR的蛋白表達，應用RT－PCR檢測PI3K、AKT及mTOR的mRNA表達水平，分析比較兩組腫瘤之間PI3K、AKT及mTOR的表達差異性。結果 在所檢測的腫瘤組織標本中，有31例為侵襲性垂體腺瘤，另外30例為非侵襲性垂體腺瘤，免疫組化結果顯示侵襲性垂體腺瘤PI3K、AKT、mTOR陽性表達率(61.29%、74.19%、54.84%)高于非侵襲垂體腺瘤(33.33%、43.33%、26.27%，P＜0.05)。PCR檢測結果顯示侵襲性垂體腺瘤組中PI3K、AKT、mTOR的相對表達量分別為(0.707±0.599、0.843±0.094、0.753±0.071)高于非侵襲性垂體腺瘤組(0.591±0.803、0.718±0.044、0.656±0.022，P＜0.05)。結論 PI3K、AKT及 mTOR 在垂體腺瘤的侵襲過程中可能發揮著促進其侵襲的作用。

垂體腺瘤 PI3K AKT mTOR 侵襲

侵襲性垂體腺瘤因其侵襲性強，手術難以完全切除，且術后復發率高等特點，成為臨床上治愈垂體腺瘤的棘手問題之一。磷酯酰肌醇－3－激酶(phosphatid－ylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB，又稱AKT)信號通路是與腫瘤細胞的生長、增殖、運動和侵襲密切相關。PI3K是一類特異的催化磷脂酰肌醇脂物質的激酶。它可被多種生長因子激活，促進下游的信號分子活化，從而發揮生物學效應。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以直接或間接活化其下游如哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin，mTOR)、p70S6K、Eif－4e 等多種分子蛋白。進而影響腫瘤細胞的各種生物學行為。mTOR是一種蛋白激酶，是AKT的下游分子。它通過調節4E－BPI和S6KI磷酸化而影響特定mRNA翻譯的開始，從而進一步達到調控細胞生長和增殖。本研究致力于三者在侵襲性與非侵襲性垂體瘤中的表達。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究垂體瘤組織來源于重慶醫科大學附屬第一醫院神經外科2009年3月至2009年12月期間所收治的61例垂體腺瘤患者。其中男24例，女37例，年齡(42.5±0.3)歲。侵襲性垂體腺瘤判斷標準:①采用Wilson的Hardy分類法［1］將Ⅲ～Ⅳ級或C、D、E期的垂體腫瘤歸為侵襲性垂體腺瘤;② 術前經影像學檢查，CT及MRI可見海綿竇、鞍旁及下丘腦等鄰近結構的破壞;③術中所取鞍底骨質或鄰近硬腦膜經病理學證實有腫瘤細胞侵犯;④術中可見鞍底骨質及硬腦膜受侵襲破壞，腫瘤突入蝶竇腔或侵入鞍旁的血管神經。符合其中之一者即可確定為侵襲性垂體腺瘤。本研究中，31例為侵襲性垂體腺瘤，30例為非侵襲性垂體腺瘤，均由病理學報告確診。手術時取所需組織用生理鹽水洗凈積血，一部分置入4%多聚甲醛溶液內固定，另一部分新鮮腫瘤組織，放入經焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理過的凍存管中，置入液氮備用。實驗所用Trizol試劑、RT－PCR試劑盒(TKKALA公司)，完成RT－PCR所需其他試劑均由重慶醫科大學眼科實驗室提供。PI3K、AKT和mTOR的單克隆抗體均購自美國Bioworld生物公司，兔抗羊IgG免疫二抗購自武漢博士德公司。SP試劑盒及DAB顯色劑購自北京中山金橋生物技術有限公司，其他試劑由重慶醫科大學組胚教研室提供。

1.2 免疫組織化學檢測(SP法) 組織標本經石蠟包埋作5μm連續切片，1張作HE染色用于重新確認病理結果。免疫組化按試劑盒操作說明進行，陰性對照選擇PBS代替一抗。陽性結果判斷標準:PI3K以細胞質呈清晰黃色或棕黃色為強陽性，AKT以細胞質呈黃色或棕黃色為強陽性，mTOR以細胞質呈清晰黃色或棕黃色為強陽性。在高倍(×400)視野下計算200個腫瘤細胞(共計5個視野，取其平均值)，計算免疫反應陽性的細胞百分比。根據半定量免疫組織化學PI3K、AKT和mTOR反應陽性細胞顯色強度及范圍進行評價:①陰性(－):無陽性細胞染色。②弱陽性(+):陽性細胞小于50%或顯色淺。③強陽性(++)陽性細胞大于50%或顯色深。見圖1。

1.3 逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)分析 參照Trizol試劑盒說明書提取腫瘤組織的總RNA，置于－80℃保存。提取的RNA含量可通過752型紫外分光光度計測定260 nm吸收值確定，按每OD260相當于40μg RNA計算RNA的產率，OD260在1.8～2.0視為抽提的RNA純度很高。本實驗采用兩步法進行RT－PCR，首先用RT試劑盒(TKKALA公司)將提取出來的RNA逆轉錄成cDNA(具體方法按照說明書進行)，逆轉錄擴增條件:37℃ 15min，85℃ 5 s。然后將cDNA產物進行PCR擴增，PCR擴增條件:94℃預變性5 min;30循環:94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min;72℃延伸10 min。制備1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2 goodview)，分別取5μL PCR產物進行電泳，紫外燈下拍照，采用圖像分析軟件Quantity One比較電泳條帶相對光密度值，從而獲得PI3K、AKT及mTOR的相對表達量。引物序列:PI3K sense 5’TACACTGTCCTGTGCTGGCTAC 3’，antisense5’GCTTCTTCTTCACTCTTCCCTA 3’，長度 408 bp;AKT sense 5’GGAGCGGGAGGAGTGGACAA 3’，antisense 5’CGGGACAGGTGGAAGAACAGC 3’，長度 441 bp;mTOR sense 5’TGGCTTCTAAGTCTACCACGACAG 3’，antisense 5’GAGGTCCTTGACATTCCCTGATT 3’，長度，359 bp;β－action sense 5’TGACGTGGACATCCGCAAAG 3’，antisense 5’CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3’，長度 200 bp。

1.4 統計學分析數據用均數±標準差(ˉx±s)表示，數據處理在SPSS 17.0上完成。統計方法中對蛋白陽性表達率的比較采用χ2檢驗，而對PCR結果的比較采用t檢驗。檢測水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化結果 在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤組織中PI3K的陽性表達率分別為61.29%(19例)和33.33%(10例)，兩組陽性表達率差異具有統計學意義(χ2=4.78，P＜0.05);AKT的陽性表達率分別為74.19%(23例)和43.33%(13例)，兩組陽性表達率差異有統計學意義(χ2=6.01，P＜0.05)。mTOR的陽性表達率分別為54.84%(17例)和26.27%(8例)，兩組陽性表達率差異亦有統計學意義 (χ2=4.80，P＜0.05)，見圖1。

2.2 RT-PCR結果 侵襲性垂體腺瘤組PI3K、AKT和mTOR的mRNA相對表達量明顯高于非侵襲性垂體腺瘤(其t值分別為 6.389，10.821，12.825;P＜0.05)。見圖2－4，表1。

圖1 A:侵襲性垂體腺瘤組織HE染色(×400);B:非侵襲性垂體腺瘤免疫組化陰性對照(－)(×400);C:侵襲性垂體腺瘤PI3K免疫組化表達陽性(++)(×400);D:非侵襲性垂體腺瘤PI3K免疫組化表達陽性(+)(×400);E:侵襲性垂體腺瘤AKT免疫組化表達陽性(++)(×400);F:非侵襲性垂體腺瘤AKT免疫組化表達陽性(+)(×400);G:侵襲性垂體腺瘤mTOR免疫組化表達陽性(++)(×400);H:非侵襲性垂體腺瘤mTOR免疫組化表達陽性(+)(×400)

圖2 PI3K mRNA在垂體腺瘤中的表達1，2，3為侵襲性垂體腺瘤，4，5，6為非侵襲性垂體腺瘤，M為marker

圖3 AKTmRNA在垂體腺瘤中的表達1，2，3為襲性垂體腺瘤，4，5，6為非侵襲性垂體腺瘤，M為Marker

圖4 mTORmRNA在垂體腺瘤中的表達1，2，3為襲性垂體腺瘤，4，5，6為非侵襲性垂體腺瘤，M為Marker

表1 垂體腺瘤組織中PI3K、AKT和m TOR的mRNA的表達

3 討論

腫瘤的發生、發展及預后是受多因素控制、多步驟調節的過程。許多學者在其他腫瘤(非垂體腺瘤)［1－2］的研究中均觀察到PI3K/AKT/mTOR的高表達，說明這三個信號分子與腫瘤細胞的增殖與侵襲等生物學行為有著密不可分的關系。

在PI3K/AKT/mTOR這個信號串聯的過程中，首先是PI3K被活化。PI3K是脂質酶家族的成員之一，普遍存在于細胞的胞質中，由一個催化亞基(p110)和調節亞基(p85)構成的異源二聚體。當PI3K被激活后，p110催化亞基可特異的磷酸化磷酸肌醇(PI)的肌糖環的D3位點，把底物Ptd Ins(4，5)P2(PIP2)轉化為Ptd Ins(3，4，5)P3(PIP3)。PIP3作為第二信使激活下游的眾多信號分子，由此導致信號的進一步傳導，使PI3K信號傳導通路在細胞的增殖、凋亡、遷移、膜泡轉運和細胞的惡性轉化等眾多病理生理過程中起重要作用［3－4］。本研究結果證實，在侵襲性垂體腺瘤中PI3K的表達明顯上調，可使第二信使PIP3明顯增多，而PIP3可以激活更多的下游靶分子，特別是AKT，從而引起該信號通路的明顯活化［5－6］。

AKT又稱蛋白激酶B(PKB)，是PI3K的下游關鍵分子。AKT一般位于細胞的胞漿中。由480個氨基酸殘基組成，包括氨基端的調節區、中間的激酶區和羧基端的尾部三部分，他們共同協調發揮AKT的生物學功能。在哺乳動物細胞中存在著三種Akt異構體(AKT l～3)，這三種由不同基因編碼的蛋白擁有80%的序列一致性，并且功能大部分相同。PI3K/Akt激活可分三步:①活化的PI3K在膜上生成PIP3;②PIP3與Akt的PH結構域結合后引起Akt向細胞膜轉位;③Akt繼而被PI3K依賴激酶1(PI3K dependent kinase 1，PDK1)在催化區的蘇氨酸308位點(Thr 308)磷酸化，同時被另一個未知的PI3K依賴激酶2(PDK2)在碳末端疏水區絲氨酸473位點(Ser 473)磷酸化，這兩個位點同時磷酸化是Akt激活的必要條件。激活后的Akt蛋白再轉位到胞漿中或胞核內，通過對一系列底物的磷酸化，激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase9、mTOR、核轉錄因子等多種生物活性分子［7－10］，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡及侵襲。

雷帕霉素受體靶蛋白mTOR，其從酵母菌到哺乳動物保持著95%的同源性，是一個高度保守的蛋白。它由一個催化結構域、一個FKBP12－雷帕霉素結合域、一個自抑制結構域、一個HEAT域和一個FAT(FRAP.ATM－TRRAP)。mTOR受 pAKT的調控，是 AKT的下游靶蛋白。Akt通過磷酸化mTOR的Ser－448位點而激活mTOR。活化后的mTOR，可通過磷酸化或去磷酸化的形式調節 4E－BP1、S6K1 等分子的生物學行為［11－12］，從而調控細胞的mRNA的翻譯過程。

侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中腫瘤細胞的性質存在區別，因此某些促進腫瘤細胞侵襲生物活性分子的活化程度以及表達程度均存在明顯差異。本研究結果顯示，在侵襲性垂體腺瘤中PI3K、AKT、mTOR的 mRNA及蛋白表達水平均存在明顯差異，侵襲組明顯高于非侵襲組，因此，可推測侵襲性垂體腺瘤可能借由該信號通路的過表達從而發揮更強的侵襲能力。

此信號通路的激活，可能通過多種方式對腫瘤的發生、發展產生作用。它可通過磷酸化Bcl－2家族成員Bad基因，從而發揮Bcl－2家族的抗凋亡作用。另外它也可抑制caspase家族，阻滯凋亡產生。它還可以活化轉錄因子NF－kB，這個轉錄因子可以促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡。除了上述提到的幾種方式，還可以通過其他的各種方式來促進細胞增殖、生長及抑制凋亡。PI3K/AKT/mTOR在其他常見腫瘤中的表達上調對多種生物活性因子的作用已得到證實［13－15］。

本課題小組的前期工作中已針對侵襲相關因子MMP、smac、caspase 等做了初步的研究［16－17］，本次研究對PI3K/AKT/mTOR在侵襲與非侵襲垂體腺瘤中的表達做了初步探索，為垂體腺瘤的相關研究提供了有用的科學資料。目前PI3K的特異性抑制LY294002已在肺癌、乳腺癌等的相關研究中證實其能有效的抑制PI3K的表達，那么如果將此特異性抑制劑用于垂體腺瘤的研究是否也能獲得相同的效果呢?所以在以后的實驗研究中，可在本研究的基礎上將LY294002加入到后續實驗中，對該信號通路進行特異性的抑制，然后可以進行再次的觀察，明確在此信號通路被抑制后，垂體腺瘤的侵襲性是否能被減弱或者被抑制。

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The Role of PI3K、AKT and m TOR in invasive pituitary adenomas.

HE Xuenong，HUOGang，TANGMaoyuan，FENG Qinglin.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.Tel:023 －89011150.

ObjectiveTo study the role of PI3K，AKT，and mTOR in invasive pituitary adenomas and explore their relationship with the invasiveness of pituitary adenomas.Methodssixty－one cases of pituitary adenomaswere divided into two groups:invasive and non－invasive groups.The protein andmRNA expression levels of PI3K，AKT andmTOR were detected by using immunofluorescence analysis and reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR).ResultsThere were 31 invasive pituitary adenomas and 30 non－invasive pituitary adenomas in all detected pituitary adenomas.PI3K，AKT and mTOR protein expression levels in invasive were higher in invasive(61.29%，74.19%and 54.84%)than in noninvasive pituitary adenomas(33.34%，43.33%and 26.27%，P＜0.05).The PCR result of PI3K、AKT、mTOR mRNA expression levelswere in invasive were higher in invasive(0.707±0.599，0.843±0.094 and 0.753±0.071)than in noninvasive pituitary adenomas(0.591±0.803，0.718±0.044 and 0.656±0.022，P＜0.05).ConclusionPI3K，AKT and mTORmay play an important role in the invasiveness of pituitary adenoma and thusmay be new targets for the treatment of invasive pituitary adenomas.

Pituitary adenoma PI3K AKT mTOR Invasion

R651

A

* 重慶市第二人民醫院神經外科(重慶 400050)△重慶醫科大學附屬第一醫院神經外科

E－mail:xiaomin198171@tom.com)

2010－12－20)

(責任編輯:甘章平)

·論 著·