一個遺傳性多巴反應性肌張力障礙家系的臨床特點及GCH-Ⅰ基因突變分析☆

薛原 陳先文 高宗良 嚴孫宏

一個遺傳性多巴反應性肌張力障礙家系的臨床特點及GCH-Ⅰ基因突變分析☆

薛原*陳先文*高宗良*嚴孫宏*

目的 探討一遺傳性多巴反應性肌張力障礙(dopa-responsive dystonia，DRD)家系臨床特點和相關基因突變。方法 收集一個多巴反應性肌張力障礙家系全部家庭成員臨床資料并隨訪，采集家系成員靜脈血，常規提取基因組DNA，利用PCR技術擴增三磷酸鳥苷環化水解酶Ⅰ(guanosine triphosphate cyclohydrolase 1，GCH-Ⅰ)基因全部6個外顯子，進行DNA直接測序并分析。結果 該家系患病成員臨床主要表現為肌張力障礙和帕金森綜合征，但癥狀嚴重程度個體差異大，所以患者對多巴絲肼治療均有較好反應，1例患者長期大劑量不規律使用左旋多巴后出現異動癥。基因測序顯示4例患病成員GCH-Ⅰ第四外顯子102號堿基由胸腺嘧啶替換為腺嘌呤(T→A)，并導致176位絲氨酸(Ser)轉變為精氨酸(Arg)Arg176 Ser，該突變類型尚未見文獻報道。其余家系成員未發現GCH-Ⅰ基因突變。結論 多巴反應性肌張力障礙臨床表現在同一家系不同個體之間可有較大差異，部分患者長期大量不規律使用左旋多巴亦可導致異動癥產生。GCH-Ⅰ基因第四外顯子102號堿基(T→A)突變是DRD患病的分子遺傳學原因之一。

多巴反應性肌張力障礙 臨床表現 GCH-Ⅰ基因 突變

多巴反應性肌張力障礙(dopa-responsive dystonia，DRD)是一種臨床較為罕見的遺傳性神經疾病，可以是常染色體顯性遺傳，也可表現為常染色體隱形遺傳。其臨床表現有兩個顯著區別于其他肌張力障礙的特點，即DRD患者肌張力變化呈晝夜波動，同時小劑量多巴胺治療可使癥狀獲得戲劇性改善并可長期維持，多巴胺不良反應罕見［1］。該病發病范圍較廣，全球均有報道。已知90%突變集中在 GCH-Ⅰ(guanosine triphosphate cyclohtdrolase 1，GCH-Ⅰ三磷酸鳥苷環化水解酶Ⅰ)基因［1－3］。在我國，發生在 GCH-Ⅰ基因外顯子1，3，6中的突變均有報道，分別為發生在第一外顯子非編碼區的 T71C及 G151A，，外顯子 3中的Gln161Pro及外顯子6的Lys224Arg。同時，發生在內含子的基因突變亦有1例為IVS5+3insT［4－7］。本文對一個臨床診斷的DRD家系的臨床表現和GCH-I基因進行分析，以助了解中國人家族性DRD臨床特征和相關的分子遺傳學特征。

1 資料與方法

1.1 家系資料 研究對象為安徽省廬江縣一DRD患病家系，臨床診斷參照文獻標準［8］。該家系見圖1。現存家庭成員12名，第一代父親已亡，具體原因不詳，母親為健康個體，第二代家庭成員現存6名，患病者4例，男1例，女3例，病程長者已達37年，短者12年，健康個體2名，男女各有1名。另有兩名第二代家庭成員已亡故，均系女性，具體原因不詳。第三代現存成員5名，女1名，男4名，尚無發病個體。家族祖父母，及其他具有血親關系個體未見具有類似癥狀者。

1.2 基因分析方法 獲得知情同意后，收集本家系母親及現存所有二代成員外周靜脈血各2 mL，EDTA抗凝。－80℃保存備用。使用北京索來寶生物工程有限公司哺乳動物全血DNA提取試劑盒(吸附柱法)常規分離白細胞后提取基因組DNA，作為PCR反應模板分裝 保 存。根 據 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.數據庫查取人GCH-I基因DNA序列，擴增全部6個外顯子，引物設計參照Bandmann等人設計的引物［9］.引物序列，及擴增片段如下表。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系配置為50 μL，其中基因組 DNA 1 μL(200 ng/μL)，上下游引物各 2 μL(30 ng/μL)，MgCl25 μL(25 mmol/L)，dNTP 10μL(25 mmol/L)，10×PCR buffer 10μL(100 mM Tris-HCl，500 mM KCl)，Taq DNA Polymerase 5 μL(1 umol/L)，ddH2O 25μL。PCR反應條件:94℃預變性5 min，隨后以94℃變性30 s，退火45 s(不同引物退火溫度不同)，72℃延伸45 s，反應35個循環后72℃延伸10min。PCR反應產物以4℃保存，經1%瓊脂糖電泳檢測擴增成功，PCR產物經純化后直接進行DNA測序，全部測序由上海生工測序部完成。

2 結果

圖1 該DRD家系的遺傳圖譜

表1 PCR反應引物序列及擴增片段長度

2.1 臨床特點 病例1(圖1中Ⅱ3):先證者，女，現年45歲，7歲起病，以步態不穩，易摔倒為首發癥狀，左側肢體較明顯，癥狀至下午加重，睡眠后可獲部分改善。發病后十年間逐漸出現雙下肢僵硬，活動不靈活，行走不穩，易摔倒。并且癥狀逐漸波及雙上肢，下午至夜間癥狀明顯加重，同時伴有咬字不清，進食緩慢，飲水嗆咳。30余歲后上述癥狀基本穩定，晨輕暮重現象已不明顯。查體:身材較矮小，反應遲鈍，構音不清，咽反射減弱。四肢肌張力齒輪樣增高，動作遲緩，內翻足，雙足趾跖屈，踝關節和足趾關節有攣縮變形，四肢腱反射活躍，病理反射未引出。3年前開始使用多巴絲肼治療，125 mg每天3次，服藥1周后，上述肢體僵硬癥狀明顯改善。1個月后，構音明顯改善，進食順利，四肢自主活動能力明顯增強，肌張力略低，生活可基本自理。追蹤回訪，該患者于2年后出現四肢肌張力低，并伴有舞蹈樣粗大不自主動作。詳細詢其問服藥及生活情況，病人自述為使癥狀繼續好轉，自行加大多巴絲肼劑量至250 mg每天3次，并有同時加服安坦等其他藥物情況，且服藥不規律，時服時斷，4年后出現雙上肢不自主運動，自己不能控制，睡眠后可消失。給予患者減少多巴絲肼用量至原劑量，停用其他藥物，并囑患者勿自行增減藥物，舞蹈癥狀消失。隨訪至今未再出現異動癥，目前多巴絲肼維持劑量187.5 mg每天3次，安坦2 mg每天3次，生活部分自理，可持仗行走。

病例2(圖1中Ⅱ5):女，42歲，36歲起病，主要表現為雙下肢僵硬不適感，左側明顯，行走稍欠靈活，其余無明顯異常，口服多巴絲肼125 mg每日1次，1周后雙下肢僵硬明顯改善，步態正常。目前持續治療已3年，未見不良反應。

病例3(圖1中Ⅱ6):女，40歲，13歲起病，起病狀態與病例1類似，查體見:表情呆滯，反應略遲鈍，肢體肌張力鉛管樣增高，肢體輪替動作遲緩笨拙，腱反射弱，病理反射未引出。四肢關節輕度攣縮變形，肌肉廢用性萎縮。治療給予口服多巴絲肼125 mg每日3次，1個月后，患者活動能力明顯改善，可獨立緩慢行走，生活基本自理。無不良反應出現。

病例4(圖1中Ⅱ8):男，33歲，12歲左右發病，同樣以雙下肢活動不自如起病，逐漸進展。現四肢有僵硬感，雙上肢動作笨拙。行走步態不穩，起坐需扶物。查體:四肢肌張力鉛管樣增高，肢體輪替動作遲緩，腱反射正常，病理征未引出。予口服多巴絲肼125 mg每天3次，1周后四肢肌張力基本正常，僅存步態輕度不穩。至今癥狀平穩無其他不適癥狀。

本家系已知4例患病成員均來自同一代，男女均有發病，其母表型正常，其父早年病故，死因不詳。患病成員均慢性起病，在數年內癥狀逐漸加重，主要表現為下肢肌張力障礙和帕金森綜合征癥狀，但進展速度和癥狀嚴重程度個體差異大。病例1(Ⅱ3)發病年齡早(7歲)，癥狀最重，除肌張力障礙癥狀外，還有突出的帕金森綜合征表現，由于家境貧困未及時診治，至診斷時已部分致殘，生活不能自理，治療后仍遺留部分功能殘疾。病例4(Ⅱ8)和病例3(Ⅱ6)臨床表現與病例1類似，但發病年齡較晚，癥狀較輕。病例2(Ⅱ5)36歲才開始發病，癥狀最輕，僅有輕度下肢肌張力障礙，無明顯帕金森綜合征癥狀。

本家系所有患者對左旋多巴治療均有較好反應，但2名患者由于未得到及時診治，已出現關節攣縮變形和肌萎縮，嚴重影響運動功能，在藥物治療前日常生活無法自理，經多巴絲肼加安坦治療后，雖然癥狀得到顯著改善，但仍遺留部分肢體功能殘疾，日常生活能力也沒有恢復到正常水平。其余2例藥物治療后功能基本恢復正常水平。本家系病例1(Ⅱ3)由于自行不規則使用大劑量多巴絲肼出現較嚴重的異動癥癥狀，藥物減量后異動癥癥狀消失。

2.2 GCH-I基因分析 在該家系，第一代母親GCH-Ⅰ基因外顯子部分經測序未發現異常，第二代4例患病者均發現在第四個外顯子第102號堿基由T轉換為A，使176位絲氨酸(Ser)轉變為精氨酸(Arg)(圖2)。其余未患病家庭成員均未檢測出相同突變。

3 討論

本家系同一代中出現4例患病者，女3例，男1例，同代其他堂表兄妹中亦無患病個體。上一代家庭成員中母親表型正常且GCH-I基因分析未發現異常，其父病故，死因不詳，遺傳模式考慮為常染色體顯性遺傳，突變基因可能遺傳自其父親。初始癥狀出現年齡從7歲到33歲，相差較大。臨床表現主要為肌張力障礙及帕金森綜合征，累及四肢軀干以及咽喉肌，起病初期具有晨輕暮重現象。個體間癥狀表現類似但程度明顯不同，病例1(Ⅱ3)7歲發病，癥狀最重，病例3(Ⅱ6)和病例4(Ⅱ8)在13～14歲發病，癥狀中等，病例2(Ⅱ5)36歲才開始發病，癥狀最輕，提示本病癥狀輕重與發病年齡有關，發病越早，癥狀越重，兒童期患病病例身體發育狀況明顯差于成年期患病個體。上述臨床特點均與國內外報道一致。

多巴反應性肌張力障礙雖然為一種遺傳性疾病，但積極治療可獲得較為滿意的療效，使患者生活質量明顯提高。在國內外文獻報道中，左旋多巴是治療該病的首選，小劑量即長期有效且無運動并發癥，本家系所有患者對左旋多巴治療有較好反應，但有2例患者未能及時得到診治，導致關節不同程度的攣縮變形，雖經治療癥狀得到明顯改善，但仍遺留有功能殘基，1名癥狀較重的患者需要使用較大劑量多巴絲肼癥狀才能得到較好控制。這一結果說明對DRD患者早期診斷、及時治療的重要性。異動癥為左旋多巴治療帕金森病時常見的不良反應，但在已有報道的DRD患者中出現極為罕見，值得注意的是該家系1名患者(病例1)在長期大劑量、不規律多巴絲肼治療后出現了肢體異常不自主運動癥狀，在藥物減量后癥狀消失，提示DRD患者如果藥物治療不當亦可引起左旋多巴誘發的異動癥，值得臨床工作中注意。

圖2 GCH-I基因外顯子4點突變測序圖。A:患病成員GCH-I基因外顯子4點突變測序圖;B:未患病成員GCH-I基因外顯子4正常序列對照

1994年，Nishivama等應用基因連鎖方法將該疾病的致病基因定位于第14號染色體上的三磷酸鳥苷環化水解酶1，(GTP cyclohydrolase 1 GCH-I)的 Iq22.1 －22.2區域。目前世界范圍內報告引起DRD發病GCH-Ⅰ基因突變有100余種，絕大部分集中在GCH-I基因的六個編碼蛋白質的外顯子區域，部分突變發生在內含子及結合部(http://www.hgmd.org/)。同時，根據已有研究，導致DRD發病的致病基因還有TH基因，通常表現為常染色體隱性遺傳方式，其臨床表現與GCHI基因突變者有一定差別。此外，仍有30%～40%的患者未能在在上述兩種基因中檢測到任何形式的基因突變。本家系基因測序顯示母親為正常個體，子代四例患者均可見到GCH-I基因第四個外顯子(exon4)上第102號堿基發生T→A的替換，引起蛋白序列第176位中性氨基酸絲氨酸(Ser)轉變為堿性氨基酸精氨酸(Arg)，引起GCH-I酶結構和功能異常，活性下降。國外文獻有相同位點突變報道，但突變形式不同，為Thr176Ser(G→C)［11］，國內尚未出現相同位點突變報道。該患病病例為常染色體顯性異常的子代雜合子。Ichionose等［12］對已知GCH-I基因異常的雜合子可引起GCH-I酶活性進行研究，提示攜帶該基因異常雜合子的個體體內GCH-I酶活性下降均在50%以上，如攜帶者酶活性下至20%左右甚至更低，則引起DRD臨床癥狀，部分攜帶者酶活性可維持在正常值的30%～40%，成為無癥狀攜帶者。

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The clinical features and identification of a novel GCH-1 genemutation in a Chinese fam ily with dopa-respon- sive dystonia.

XUE Yuan，CHEN Xianwen，GAO Zongliang，YAN Sunhong.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University.218 Jixi Road，Hefei.230022.China.Tel:0551 －2922114.

ObjectiveTo study the clinical features of dopa-responsive dystonia(DRD)and guanosine triphosphate cyclohydrolase 1(GCH-1)genemutation in a Chinese family.Methods This family had been followed up for three years after confirmation of diagnosis.Blood samples were collected from the familymembers and their genome DNA was extracted by standard technique.PCR and DNA sequencer were used to amplify all of6 exons of GCH-1 gene，and sequence PCR products，respectively.Resu lts The clinical features weremainly dystonia and parkinsonism.But the symptom severity varied among affected individuals.All affected familymembers had quite good response to levedopa treatment except one patient developed severe dyskinesia after a long-term high-dose treatment，which was rarely reported before.DNA sequencing showed a novel pointmutation with transition of T to A at the 102 base of exon 4 of GCH-1 gene，resulting in a substitution of arginine by serine at pointof176 in the GCH-1 protein in the 4 affectedmembers.Conclusions The symptom severity of DRDmay vary significantly among individuals even in the same family.In rare cases，patient can developed severe dyskinesia after long-term improper high-dose levedopa therapy.Mutation wit T→A at point102 of exon 4 in GCH-1 gene should be considered as a novel pathogenic mutation for dopa-responsive dystonia.

Dopa-responsive dystonia Clinical features Guanosine triphosphate cyclohydrolase 1(GCH-1)gene Mutation

R596

A

☆安徽省科技廳科技項目(編號:10021303036)

* 安徽醫科大學第一附屬醫院神經內科(合肥 230022)

E-mail:chxwmail@yahoo.com.cn)

2010－10－12)

(責任編輯:李 立)

·短著述·