pEGFP-ING4抑制裸鼠皮下人U87移植瘤生長及腫瘤血管生成

鄧躍飛 趙義營 雷炳喜 牛江濤

pEGFP-ING4抑制裸鼠皮下人U87移植瘤生長及腫瘤血管生成

鄧躍飛*趙義營*雷炳喜*牛江濤*

目的 探討pEGFP－ING4對裸鼠體內人U87細胞移植瘤生長及對腫瘤血管生成的影響。方法 將成功構建的18只人U87細胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分為pEGFP－ING4和pEGFP－C2轉染組及PBS空白對照組3組，測量各組腫瘤的體積變化，熒光顯微鏡觀察轉染瘤體內綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達情況，免疫組織化學SABC法檢測微血管密度(microvessel density，MVD)。結果 熒光顯微鏡下pEGFP－ING4組和pEGFP－C2組均觀察到GFP表達，接種后第21d、28d、35d各組皮下腫瘤體積(mm3)為:PBS組(201.8±19.3，418.9±26.4，622.1 ± 51.3)，pEGFP－C2 組(197.6 ± 18.9，398.4 ± 20.4，593.7 ± 48.7)，pEGFP－ING4 組(138.9 ± 8.4，198.7±21.5，293.2±31.6)，腫瘤接種后在同一時間點內，pEGFP－ING4組腫瘤體積明顯小于另外兩組(P＜0.05);MVD 檢測(個/mm2):PBS組(15.83±0.98)，pEGFP－C2 組(15.83±1.62)，pEGFP－ING4 組(4.17±1.17)，與另外兩組比較，pEGFP－ING4組MVD明顯降低(P＜0.01)。結論 ING4基因能夠明顯抑制人U87細胞裸鼠皮下移植瘤的生長，抑制膠質瘤血管的生成可能是其抗腫瘤的重要機理之一。

生長抑制基因4 血管生成 成瘤模型 膠質瘤

自1996年 Garkavtsev［1］通過消減雜交分析在正常乳腺上皮細胞與幾種乳腺癌細胞株之間發現了生長抑制因子(inhibitor of growth，ING)家族第一個成員ING1以來，隨后陸續發現了ING2、ING3和ING5等其他成員。近期研究表明ING4在細胞生命活動中起重要作用，廣泛參與腫瘤發生發展的多個過程，包括腫瘤血管的生成、細胞對缺氧狀態的適應、細胞間接觸抑制的丟失、抑制腫瘤細胞侵襲轉移以及細胞凋亡與生長周期調節等［2－5］。目前抑制腫瘤血管生成已成為膠質瘤治療的重要策略之一［6］，我們通過前期已構建的含有ING4基因片段pEGFP－ING4質粒，進一步研究該基因對動物體內人U87皮下移植瘤生長及腫瘤血管生成的影響，為進一步的研究腦膠質瘤的發病機制和治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 4～6周齡裸小鼠(BALB/c nu/nu)30只，雌雄不限，體重15～17 g，由中山大學動物實驗中心提供。飼養于中山大學動物實驗SPF動物房中。人腦膠質瘤細胞株(U87)由中山大學孫逸仙醫院中心實驗室提供。U87細胞用含有10% 的新鮮胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100mg/mLDMEM高糖培養基培養，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養。pEGFP－C2 質粒(美國 Invitrogen 公司)、pEGFP－ING4質粒(本課題組前期構建)均含有新霉素抗性基因。DH5α感受態細胞(TIANGEN公司)。胎牛血清、高糖DMEM培養基、LB培養基(美國GIBCO公司)，高純度質粒大提取試劑盒(TIANGEN公司)，兔抗人ING4抗體(美國PTG公司)，轉染試劑PEI(南京惠基生物技術有限公司)，SABC免疫組化試劑盒、DAB(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 質粒 DNA 的制備 pEGFP－C2質粒和 pEGFPING4質粒分別按說明書轉化感受態大腸桿菌DH5α，然后加到含卡那霉素的LB固體瓊脂培養基上，用無菌彎頭玻璃棒將細胞均勻涂開，置于室溫直至液體吸收后，倒置平板，37℃培養12h觀察菌落生長情況。挑取一個單菌落，蘸進 4 mL LB－Kana液體培養基(50 μg/mL)中，225 r/min震蕩過夜，嚴格按無內毒素質粒大提試劑盒(離心柱型)(EndoFree PlasmidKit)說明書操作，質粒提取后送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。

1.3 細胞移植、基因轉染及載瘤裸鼠分組治療 30只裸鼠每只按1×108個U87細胞接種于前腋窩皮下，常規飼養。接種約2周后，除3只裸鼠皮下未成瘤、2只腫瘤最大直徑＜5 mm、4只實驗途中死亡退出實驗外，余下21只隨機選擇18只分為 pEGFP－ING4組 、PEGFP－C2組和PBS組(空白對照組)各6只。吸取5 μL質粒(1μg/μL)、10μL PBS在1.5mL離心管混勻再加入10μLGenEscort)，靜置10min后用25μL微量注射器在距腫瘤5 mm左右進針，皮下移行到腫瘤部位，多點緩慢注射，每只裸鼠每次注射25μL，每3 d一次，共注射7次。每天密切觀察裸鼠的生長情況。每周用游標卡尺測量腫瘤的最長徑(a)及最短徑(b)。腫瘤體積計算公式:V=ab2/2。實驗結束后斷頸處死所有的裸鼠進行實驗。

1.4 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達的觀察 處死后迅速取出各組裸鼠皮下移植瘤并置于冰盒中，送中山大學孫逸仙紀念醫院病理科制作快速冰凍切片。切片制作成功后保存于冰盒中，并迅速轉運到實驗室熒光顯微鏡下觀察。

1.5 SABC法測定微血管密度 裸鼠腫瘤組織放入甲醛中固定，石蠟包埋，并由中山大學孫逸仙紀念醫院病理科制作石蠟切片。切片經二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，0.3%H2O2甲醇溶液室溫下浸泡，微波修復抗原，10%山羊血清封閉切片。按步驟先后滴加1∶50稀釋的CD34一抗、生物素化二抗和SABC液，用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照。滴加新鮮DAB顯色液至切片，避光顯色后終止反應。梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察并攝影。參考有關文獻［7］對各組裸鼠腫瘤組織CD34染色切片進行微血管密度(microvessel density，MVD)計數:染成棕色的血管內皮細胞或血管內皮細胞群，只要它們與鄰近微血管、腫瘤細胞或其它結締組織分開，就視為一個微血管;同一個血管的“頭”和“尾”正好在一個切面上，作兩個微血管計算，血管腔和紅細胞不作為判斷血管的標準。先在100倍視野下觀察整張切片的血管分布情況，確定腫瘤區域內微血管最密集的5個區域，即“熱點”;再在200倍光鏡下計數每個區域內的血管數，取5個區域的平均值，作為該只裸鼠腫瘤的MVD。

1.6 統計學處理 所有數據采用SPSS13.0處理。計量資料用±s表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，多組均數間兩兩比較采用 Student－Newman－Keuls法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 質粒鑒定和測序 重組質粒經雙酶切后，在700bp處可見一條光亮條帶，這與我們研究的目的基因ING4的大小相符(圖1)。將重組質粒pEGFP－ING4送測序，插入序列為700 bp，并證明pEGFP－C2的開放讀碼框是正確的。將測序所得結果輸入GenBank。以Blast分析比較核苷酸數據庫中的序列，與已公布的ING4序列完全一致。

圖1 雙酶切后凝膠電泳圖。2道為marker由右到左依次指示10000 bp，8000 bp，6000 bp，5000 bp，4000 bp，3000 bp，2500 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp.最亮條帶是3000bp和1000bp。1道為雙酶切產物，在10000bp附近有一條條帶為開環的pEGFP載體質粒，1000bp附近有一條條帶為ING4

2.2 質粒轉染腫瘤細胞的觀察 我們前期實驗成功構建的真核表達載體pEGFP－ING4，其被轉染進細胞后在強啟動子CVM的作用下表達ING4和GFP，通過快速冰凍切片熒光顯微鏡檢查觀察GFP的表達即可驗證目的基因是否被轉染進瘤體內。結果顯示pEGFPC2組和pEGFP－ING4組快速冰凍切片熒光顯微鏡下均有腫瘤細胞發出綠色熒光，而PBS組則未見有綠色熒光細胞(圖2)，表明質粒已被成功轉染進瘤體內，目的基因ING4已經在瘤體內細胞表達。

2.3 腫瘤細胞的生長 治療前，各組裸鼠大小差異無統計學意義(P=0.485)。當腫瘤接種2周后，3組已經載瘤裸鼠(6只/組)每3d被分別腫瘤內注射pEGFP－ING4、pEGFP－C2、PBS，每天觀察裸鼠及腫瘤的生長情況，每周測量一次腫瘤體積大小。與pEGFP－C2組、PBS組相比，pEGFP－ING4組腫瘤的生長被明顯的抑制，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。腫瘤的生長曲線(圖3)亦顯示pEGFP－ING4組腫瘤的體積明顯的小于其余兩組。實驗過程中各組裸鼠未發生意外死亡，各組裸鼠活動自如，反映靈敏，進食飲水正常。

2.4 MVD的檢測結果 應用免疫組化染色檢測CD34的表達，各組 MVD分別為(個/mm2):PBS組15.83 ±0.98，pEGFP－C2 組 15.83 ±1.62 ，pEGFP－ING4組4.17±1.17。pEGFP－ING4組與其他兩組相比明顯降低，MVD具有統計學差異(P＜0.001)，見圖4。

3 討論

腫瘤抑制基因在抑制腫瘤生長和血管生成方面起著重要作用，但在腫瘤細胞中常常處于滅活狀態，對如何在腫瘤細胞中恢復抑癌基因的功能是目前腫瘤基因治療領域一個研究熱點［6，8－9］。ING4 是近年新發現的腫瘤生長抑制基因之一，因其可明顯抑制多種腫瘤細胞生長和腫瘤血管的生成而越來越受到人們的重視，在胃癌、胰腺癌和人肺癌細胞等研究證實:ING4能夠抑制腫瘤細胞的生長，誘導腫瘤細胞凋亡［2－3，5，10］。在神經膠質瘤研究中發現ING4基因的表達水平與神經膠質瘤的惡性程度呈負相關，ING4基因的表達明顯低于正常人，Ⅳ級膠質細胞瘤中ING4mRNA的含量較正常腦組織下降6倍，而Ⅱ－Ⅲ級膠質瘤中的含量僅下降2～3倍［11］。在本體內實驗研究中，轉染pEGFP－ING4組的腫瘤的生長速度明顯受到抑制，與pEGFP－C2組和PBS組相比，pEGFP－ING4組腫瘤體積明顯小于前兩組，顯示ING4基因能夠明顯抑制人膠質瘤U87細胞裸鼠皮下移植瘤的生長。

圖2 熒光顯微鏡下U87移植瘤GFP的表達(200×)。A1為轉染pEGFP－C2組，圖中的細胞發出綠色熒光，表明pEGFP－C2已經被轉染進瘤體內并成功表達;B1為轉染pEGFP－ING4組，圖中的細胞發出綠色熒光，表明pEGFP－ING4已經被轉染進瘤體內并成功表達;C1為轉染PBS組，未發現熒光。A2，B2，C2為各處理組對應的普通光下照片。

表1 各組不同時間點裸鼠U87皮下移植瘤體積(mm3)

圖3 異體U87人腦膠質瘤生長曲線

圖4 各處理組見CD34的染色(200×)。a為PBS治療組，b為pEGFP－C2組，c為 pEGFP－ING4組。圖 a和圖 b中可見很多染成棕黃色細胞血管內皮細胞，而圖c中只有少量染成棕黃色的血管內皮細胞

雖然目前已證實ING4能誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等作用，但其分子機理未明，有研究認為ING4蛋白通過與NF－κB的p65亞基相互作用來抑制IL－8的表達，減少腫瘤內血管生成，降低血管密度并使血管管徑縮小，因而抑制腫瘤生長［2，11－13］。我們也在實驗中觀察到轉染PEGFP－ING4組的腫瘤血管內皮CD34的表達明顯減弱，與PEGFP－C2組和PBS組相比，pEGFP－ING4組微血管密度明顯低于前兩組，表明ING4基因的過表達抑制了U87皮下移植瘤的血管形成，使pEGFP－ING4組的微血管密度較其余兩組明顯降低，提示ING4基因可能通過抑制腫瘤的血管生成來抑制腫瘤的生長，這也證實了ING4基因抑制血管生成是其發揮作用的重要途徑。但近年有研究報道ING4基因并沒有和P53基因直接結合或者結合很弱，同時認為ING4是通過參與組蛋白的修飾并與染色體上特異位點結合來發揮其調節作用［14］，ING4基因的過表達強烈抑制了人臍靜脈內皮細胞的生長和它們形成管狀結構的能力，同時ING4通過抑制NF－κB的活性來影響白介素－6的表達［15］。我們同期的體外實驗研究證實ING4基因具有明顯抑制U251膠質瘤細胞生長和促進其凋亡的作用，但發現其作用機制可能是通過誘導凋亡但不通過抑制VEGF的表達有關。因此，抑制膠質瘤血管新生的機制有待進一步的深入研究。

本實驗選用的 pEGFP載體攜帶有GFP綠色熒光蛋白報告基因和Kanak/neok基因，當其被轉染進腫瘤細胞并被成功表達后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色，能直觀的檢測到目的基因是否被轉染進瘤體內。本研究結果顯示pEGFP－C2組和pEGFP－ING4組的快速冰凍切片中均在熒光顯微鏡下觀察到發出綠色熒光的腫瘤細胞，而PBS組則未見有綠色熒光細胞，表明質粒已被成功轉染進瘤體內，目的基因ING4已經在瘤體內細胞表達。與病毒載體相比，雖然本實驗采用了可生物降解的陽離子脂質體作為運送目的基因的手段，避免了病毒載體的免疫原性、毒性、成瘤性以及對動物的毒性，但與病毒相比，其轉染效率相對較低，使其使用受到限制，這也是本實驗下一步需要改進之處。

綜上所述，我們通過人膠質瘤U87細胞裸鼠皮下移植瘤動物模型成功轉染PEGFP－ING4進入腫瘤細胞，實驗結果顯示ING4基因對裸鼠皮下膠質瘤生長和腫瘤血管的生成產生了明顯的抑制作用，但其具體的作用部位、靶點或關鍵環節，有待于進一步的探討和研究。

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The inhibitory effects of pEGFP-ING4 on grow th and angiogenesis of human glioma U87 cell xenografts in nudem ice.

DENG Yuefei，ZHAO Yiying，LEIBingxi，NIU Jiangtao.Department of Neurosurgery，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，YanJiangWest Road 107，Guangzhou，Guangdong 510120，China.Tel:020 －81332539.

ObjectiveTo study the effects of pEGFP－ING4 on the growth and angiogenesis of human U87 cells xenografts in nudemice.MethodsThe xenografts derived from U87 cellswere established in 18 BALB/C nudemice.Inoculated mice were randomly divided into 3 groups:pEGFP－ING4，pEGFP－C2 and PBS groups.Tumor volume was measured and microvessel density(MVD)were detected using SABC immunohistochemistry.The expression of green fluorescent protein(GFP)was detected using a fluorescentmicroscope.ResultsGFP could be detected in pEGFP－ING4 and pEGFP －C2 groups but not in PBS group undermicroscope.After tumor inoculation，the 21th ，28 th ，35 th day the volume(mm3)of each group is:PBS group(201.8±19.3，418.9±26.4 ，622.1±51.3)，pEGFP－C2 group(197.6±18.9 ，398.4±20.4 ，593.7±48.7)，pEGFP－ING4 group(138.9±8.4 ，198.7±21.5，293.2±31.6).Compared with the other two groups at the same time，pEGFP－ING4 group was suppressed significantly(P＜0.05).The MVD was:PBS group(15.83±0.98)，pEGFP－C2 group(15.83±1.62)，pEGFP－ING4 group(4.17±1.17)，the MVD in pEGFPING4 group was significant reduction(P＜0.01)compared with the other two groups.ConclusionING4 gene can inhibit the growth of U87 cell xenografts in nudemouse.The inhibition of angiogenesismight play a key role in the antitumor effect of ING4.

Inhibitor of growth 4 Angiogenesis Tumormodel Glioma

R739.41，R730.231

A

☆廣東省科技計劃項目基金(編號:2007B031514001)

* 中山大學附屬孫逸仙醫院神經外科(廣州 510120)

E－mail:fly040@sohu.com)

2011－04－08)

(責任編輯:甘章平)

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