DPP Ⅳ基因影響卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制探討

王忠民 盧永科

（1 大連婦產(chǎn)醫(yī)院婦二科，遼寧 大連 116033；2 大連醫(yī)科大學(xué)毒理學(xué)研究所，遼寧 大連 116021）

卵巢腫瘤是女性生殖器常見的腫瘤之一，其中惡性卵巢癌約占10%，居女性生殖器惡性腫瘤的第3位，而上皮性卵巢癌是婦產(chǎn)科惡性腫瘤中主要的死亡原因。卵巢癌患者一方面由于卵巢的盆腔解剖特點(diǎn)，加之目前缺乏特異性的診斷方法，造成了早期發(fā)現(xiàn)的困難性，所以卵巢癌在臨床經(jīng)常是潛行的，在確診時(shí)已近晚期。發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期病例雖然通過提高手術(shù)技巧可以做到最大程度的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)同時(shí)結(jié)合包括鉑類、紫杉醇類以及眾多二線化療藥物在內(nèi)的綜合治療手段，但是卵巢癌患者的5年生存率仍然很低[1]。卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要方式是直接種植播散、淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移。如能抑制和治療卵巢癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移對(duì)提高5年生存率是有意義的。隨著分子生物學(xué)和腫瘤基礎(chǔ)研究的飛躍發(fā)展，使人們認(rèn)識(shí)到腫瘤最終是一種基因病。基于此認(rèn)識(shí)人們可以從分子和基因水平探索卵巢癌的病因和發(fā)病機(jī)制并尋找卵巢癌的診斷和治療方法。人類DPP Ⅳ基因定位于2q24，約90kb，含26個(gè)外顯子。它編碼766個(gè)氨基酸的多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約110×103的跨膜糖蛋白[2]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)DPP Ⅳ基因在腫瘤進(jìn)展中起重要作用[3,4]，但是其具體作用機(jī)制研究比較少。我們此次探討DPP Ⅳ基因抑制卵巢癌細(xì)胞系惡性行為的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞系：HO-8910PM卵巢癌細(xì)胞系是來自于人類卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌，購于中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；將真核表達(dá)載體PcDAN3.1（+）和全長野生型DPP Ⅳ基因通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HO-8910PM卵巢癌細(xì)胞系，分別命名為HOPcDAN和HODPP Ⅳ細(xì)胞。HODPP Ⅳ細(xì)胞高表達(dá)DPP Ⅳ基因，以上細(xì)胞轉(zhuǎn)染及建立均由本實(shí)驗(yàn)室完成。HO-8910PM細(xì)胞系培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，其中含10%FCS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。HOPcDAN和HODPPⅣ細(xì)胞培養(yǎng)于上述培養(yǎng)液，另外還加入400μg/mLG418維持壓力篩選。3種細(xì)胞均置于37℃的5%濃度CO2孵育箱中培養(yǎng)。

侵襲小室（Mill cell Chamber）購于BD公司。

1.2 試劑

碘化丙啶（PI）購于北京岳泰生物公司；吖啶橙購于上海聚源生物科技有限公司；G418購于Invitrogen公司；凋亡DNA梯形檢測試劑盒（TACS Apoptotic DNA Laddering Kit，Trevigen，Inc）；兔抗人Bcl-2和Fas單克隆購于Sigma公司；人工基質(zhì)膠（Matrigel）購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞（FCM）法測定不同卵巢癌細(xì)胞系的凋亡率及細(xì)胞周期

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細(xì)胞分別取5×104個(gè)制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS漂洗兩次后離心，100目篩網(wǎng)過濾離心。加入PI工作液0.5mL（工作濃度10μg/mL），室溫避光放置30min后，利用流式細(xì)胞儀檢測。檢測前以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)，使其穩(wěn)定在2%范圍內(nèi)。檢測時(shí)收集2×104個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)級(jí)放大，光散射數(shù)據(jù)存盤。數(shù)據(jù)利用Macintosh 650計(jì)算機(jī)上的Modifit軟件分析。利用設(shè)門的方法（橫坐標(biāo)前向角，縱坐標(biāo)側(cè)向角）將壞死細(xì)胞框除，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.2 吖啶橙染色觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

3種細(xì)胞分別取5×104個(gè)制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS漂洗兩次后離心，100目篩網(wǎng)過濾離心。蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，分別加入3種經(jīng)過上述方法處理的細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細(xì)胞爬行于玻片后，PBS液漂洗3次，每次3min。吸凈PBS液后將配制好的吖啶橙溶液滴于蓋玻片上，直接反轉(zhuǎn)，放于潔凈蓋玻片上，熒光顯微鏡觀察，攝片。

1.3.3 DNA Ladder 測定

實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按TACS Apoptotic DNA Laddering Kit操作說明進(jìn)行。

1.3.4 透射電鏡觀察

透射電鏡標(biāo)本制作參考文獻(xiàn)[5]。

1.3.5 Wester blot 檢測Fas/Bcl-2基因表達(dá)

具體操作參考文獻(xiàn)[6]。采用TAKARA公司提供的Image Master ED Elite V3.01分析軟件對(duì)Wester blot圖像進(jìn)行光密度掃描，計(jì)算DDP IV/β-actin比值，用以比較各細(xì)胞DDP IV基因蛋白表達(dá)水平差異。

1.3.6 不同卵巢癌細(xì)胞增殖

取HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ卵巢癌細(xì)胞，以8000個(gè)細(xì)胞/200μL/孔 分別接種于96孔培養(yǎng)板，同時(shí)與試驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，從接種后第24h開始每種細(xì)胞每天取6孔，采用MTT法檢測細(xì)胞活性。選492nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度（absorbance A492值），取6孔平均值記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫軸，A492值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線，連續(xù)測定7d。

1.3.7 細(xì)胞體外黏附試驗(yàn)

具體操作參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.8 體外細(xì)胞侵襲測定

細(xì)胞侵襲性測定使用Matrigel侵襲小室，具體操作參考文獻(xiàn)[8]。

1.3.9 體外細(xì)胞趨化能力測定

方法步驟與體外侵襲力測定相同，只是侵襲小室的濾膜不用人工基質(zhì)膠覆蓋。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)細(xì)胞結(jié)果均重復(fù)6次。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，計(jì)量資料以表示。利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），計(jì)數(shù)資料多樣本間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 不同細(xì)胞系的凋亡率及細(xì)胞周期

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細(xì)胞在細(xì)胞周期G1期前均出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。但是HODPP Ⅳ細(xì)胞的凋亡峰更明顯。HODPPⅣ細(xì)胞凋亡率顯著高于HO-8910PM、HOPcDNA細(xì)胞（P＜0.05）；HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞凋亡率比較無顯著性差異（P＞0.05）。具體數(shù)值見表1和圖1。

表1 3種細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期的變化（%）

2.2 吖啶橙染色細(xì)胞凋亡形態(tài)

HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞未發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞核為均勻黃色或黃綠色熒光，核內(nèi)RNA為紅色，細(xì)胞質(zhì)為桔紅色或紅色；當(dāng)HODPPⅣ細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核組成成分從細(xì)胞上分離，形成典型的凋亡小體。或細(xì)胞膜僅包裹部分細(xì)胞質(zhì)從細(xì)胞上分離，形成不典型的凋亡小體。見圖2、圖3。

2.3 細(xì)胞凋亡的DNA梯形圖

HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞未發(fā)生凋亡時(shí)電泳后無梯形條帶出現(xiàn)，HODPP Ⅳ細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)電泳后可出現(xiàn)明顯的梯形條帶，見圖4。

2.4 透射電鏡觀察凋亡形態(tài)

圖1 3種細(xì)胞亞二倍凋亡峰及細(xì)胞周期變化

圖2 熒光顯微鏡下HO-8910PM、HOPcDNA細(xì)胞未發(fā)生凋亡（10×40）

圖3 熒光顯微鏡下HODPP Ⅳ細(xì)胞發(fā)生凋亡（10×40）

圖4 HO-8910PM、HOPcDNA和HODPPⅣ細(xì)胞DNA梯形圖檢測

圖5 透射電鏡下HO-8910PM、HOPcDNA細(xì)胞未發(fā)生凋亡（上）及HODPP Ⅳ細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)（下）（×6000）

在透射電鏡可見：當(dāng)HODPP Ⅳ細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞漿濃縮，線粒體輕度腫脹，細(xì)胞漿內(nèi)見空泡增多；細(xì)胞膜保存完整，細(xì)胞膜表面微絨毛和偽足減少或消失；細(xì)胞膜出現(xiàn)出芽、出泡現(xiàn)象。細(xì)胞核濃縮和邊集甚至發(fā)生破碎（圖5）。

2.5 Fas/Bcl-2基因蛋白表達(dá)水平

HODPP Ⅳ細(xì)胞Fas基因蛋白表達(dá)水平明顯高于HOPcDNA和HO-8910PM細(xì)胞（P＜0.05）；HOPcDNA細(xì)胞和HO-8910PM細(xì)胞比較無差異（P＞0.05）。HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞Bcl-2基因蛋白表達(dá)水平明顯高于HODPP Ⅳ細(xì)胞（P＜0.05）；HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞比較無差異（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 Wester blot檢測Fas基因表達(dá)水平

圖7 Wester blot檢測Bcl-2基因表達(dá)水平

2.6 細(xì)胞增殖曲線

所有細(xì)胞在前4d均處于緩慢的增殖狀態(tài)，4d后3種細(xì)胞才開始進(jìn)入相對(duì)較快的增殖狀態(tài)。HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞增殖速度比較無顯著性差異（P＞0.05）；而HODPP Ⅳ細(xì)胞在7d內(nèi)的增殖速度始終低于HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異（P＜0.01），見圖8。

圖8 不同細(xì)胞系增殖曲線

2.7 體外細(xì)胞侵襲性測定

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP IV細(xì)胞侵襲到膜下和侵襲小室下室的平均細(xì)胞數(shù)分別為（138.67±3.06）、（136.00±3.61）和（61.33±3.06）。HO-8910PM與HOPcDNA細(xì)胞系比較無顯著性差異（P=0.912）；HODPP Ⅳ細(xì)胞顯著低于HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞（P＜0.001）。

2.8 體外細(xì)胞移動(dòng)性測定

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP Ⅳ細(xì)胞系侵襲到膜下和侵襲小室下室的平均細(xì)胞數(shù)分別為（204.67±2.89）、（208.00±9.64）和（125.67±6.43）。HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞系比較無顯著性差異（P=0.944）； HODPP Ⅳ細(xì)胞顯著低于HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞（P=0.001；P=0.002）。

2.9 不同細(xì)胞系的黏附試驗(yàn)

HO-8910PM、HOPcDNA和HODPP IV細(xì)胞系黏附細(xì)胞數(shù)分別為（144.33±4.73）、（140.67±3.22）和（72.33±3.22）。HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞系比較無顯著性差異（P=0.28）； HODPP IV細(xì)胞顯著低于HO-8910PM和HOPcDNA細(xì)胞（P＜0.001）。

3 討 論

細(xì)胞表面表達(dá)的DPP Ⅳ基因最初作為T細(xì)胞激活分子，目前認(rèn)為是免疫系統(tǒng)細(xì)胞激活的普遍標(biāo)志物。DPP Ⅳ組織分布比較廣泛，但是在不同組織之間表達(dá)差別很大。在一些腫瘤細(xì)胞DPP Ⅳ的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲力呈正相關(guān)性[2,9-12]。我們在前期工作中也得出相同結(jié)論[13]。為了研究DPP Ⅳ基因的高表達(dá)對(duì)高轉(zhuǎn)移能力的卵巢癌細(xì)胞系生物行為的影響，我們利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將人類全長野生型DPP Ⅳ基因轉(zhuǎn)染到人類卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM細(xì)胞中，經(jīng)G418壓力篩選后克隆出1株高表達(dá)DPP Ⅳ基因的卵巢癌細(xì)胞系命名為HODPPⅣ，用于卵巢癌細(xì)胞中DPP IV基因功能的研究。結(jié)果顯示，在體外的研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了DPP Ⅳ基因的HODPP Ⅳ細(xì)胞與母系HO-8910PM、HOPcDNA細(xì)胞系比較，其細(xì)胞增殖能力、黏附性、移動(dòng)性和侵襲性顯著降低。研究表明DPP Ⅳ基因的高表達(dá)和其蛋白產(chǎn)物的高活性有抑制腫瘤細(xì)胞惡性表型的作用。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。由于它在保證多細(xì)胞生物的健康生存過程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用，引起了人們對(duì)其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)一種很有趣的現(xiàn)象，光鏡下母系HO-8910PM細(xì)胞和HOPcDNA細(xì)胞大多數(shù)細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞呈鋪石狀排列，核大、深染，核仁清晰，染色質(zhì)顆粒粗，核分裂相易見；而HODPPⅣ細(xì)胞呈現(xiàn)圓形和橢圓形，細(xì)胞核明顯縮小，大部分細(xì)胞相互接觸，呈現(xiàn)較為緊密排列狀生長，且細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低。為了研究此現(xiàn)象發(fā)生的原因，本研究嘗試應(yīng)用了多種方法從不同層面探討細(xì)胞凋亡是否在其中起作用。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了DPP Ⅳ基因并高表達(dá)DPP Ⅳ基因的HODPP Ⅳ細(xì)胞在細(xì)胞各個(gè)不同增殖期均出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象；同時(shí)在高表達(dá)DPP Ⅳ基因的HODPP Ⅳ細(xì)胞中凋亡促進(jìn)基因Fas高表達(dá)，而凋亡抑制基因Bcl-2卻明顯低表達(dá)。國外學(xué)者[4]在研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。本研究結(jié)果提示凋亡機(jī)制是DPP Ⅳ基因抑制高轉(zhuǎn)移潛能卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM惡性行為的機(jī)制之一。

綜上所述，DPP Ⅳ基因在各種良、惡性腫瘤中具有很多生物學(xué)功能。由于DPP Ⅳ基因與腫瘤的相關(guān)性是在近年才被關(guān)注，因此相關(guān)的研究資料有限，在這里尚無法完全的剖析和解釋其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制。目前國際上許多學(xué)者正致力于研究DPP Ⅳ基因的表達(dá)水平及其酶的活性在各種組織環(huán)境中的不同生理學(xué)作用。雖然DPP Ⅳ基因是一個(gè)有用的診斷和預(yù)后的指標(biāo)，但是目前尚未有關(guān)將誘導(dǎo)或抑制DPP Ⅳ基因表達(dá)作為治療手段的報(bào)道，但是隨著DPP Ⅳ基因在惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制中生物學(xué)作用的逐漸明確，有望在準(zhǔn)確地理解DPP Ⅳ基因生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上，找到治療惡性腫瘤的新的途徑和方法。

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