兩個脯氨酸有機催化劑合成的正交優化和HPLC－MS/MS對其結構的鑒定

鄭 敏，彭敬東，吳傳隆，王 寧

（西南大學化學化工學院，重慶 400715）

近年來，高效液相色譜與串聯質譜（HPLCMS/MS）聯用已發展成為科研和日常分析中最有力的一種工具，在各種應用領域中都有廣泛的應用[1]。隨著新的電離方法，尤其是電噴霧電離源（ESI）的出現，HPLC－MS/MS法更牢牢確立了其在研究中的重要地位。電噴霧電離源的一級質譜中，分子離子峰豐度高，干擾小；電噴霧電離源的電離效率高，足以滿足多級質譜離子或化合物斷鍵的需要；同時，解析分子離子的同位素峰也可確定離子帶電數和相對分子質量，可使質量分析器檢測的質量提高幾十倍甚至上百倍；加之ESI可以很方便地與液相色譜分離技術連接，通過調節液相分離條件和調整控制電壓離子源，就能很容易地使得離子斷裂，獲取結構信息。將液相色譜的高分離特性和質譜的高靈敏度、高選擇性結合，可以簡化樣品的前處理，提供未知樣品的結構和質量數據，縮短分析時間[2－8]。同時，質譜的強定性能力不再因HPLC常用的檢測手段——紫外或熒光檢測器要求底物必須具備生色團而受到限制，HPLC－MS這一技術必將得到廣泛的應用。

小分子的脯氨酸催化劑，現在仍然是很適用的有機催化劑[9－10]。無論在經濟成本和簡單實用方面，它都是其他很多有機催化劑無法比擬的。然而，未經修改的脯氨酸有一個致命的缺點，即自身缺乏疏水基團，同時還不含生色團，其催化合成的對應異構體多需要在非極性環境下生成。因為好的對映體的誘導很難或者不可能在水介質中發生[10，11－13]，因此無論是給脯氨酸鍵合上必要的疏水基，還是脯氨酸的脫保護過程，都是復雜、耗時的，鑒定也是很難進行的。本工作采用Kristensen等[10]建立的方法，直接通過CF3CO2H羥酰化這一步選擇性的在脯氨酸的間位引入非極性基團，合成得到兩個O－酰基衍生物鹽酸鹽結晶物。

已有許多文獻報道了HPLC－MS/MS法的有價值的應用，科學家們對液質聯用的興致也提高了很多[14－15]。然而，目前卻只有很少的研究報道了高效液相色譜－串聯質譜在線監測反應的定性分析。本工作為了通過高效液相色譜－串聯質譜的快速分離和高靈敏度、強定性的功能找到最佳的合成反應條件，通過正交水平因素法研究各條件對反應的影響強弱，以更好的控制反應。兩個缺乏生色團的O－酰基－4－羥基脯氨酸鹽酸鹽有機催化劑在優化好的反應條件下進行合成。通過液質聯用能有效地監控這兩個O－酰基－反式－4－羥基脯氨酸鹽酸鹽有機催化劑的合成，并對產物進行鑒定，從而解釋反應機理，拓展HPLC－MS的應用范圍。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司產品，配有Agilent化學工作站系統軟件；Bruker核磁共振儀（300M，NMR），Bruker Daltonics HCT質譜儀（配有Bruker工作站）：美國Bruker公司產品。

1.2 主要材料與試劑

O－4－羥基脯氨酸和酰氯（分析純）：美國Sigma公司產品；CF3CO2H，乙醚和甲酸（分析純）：成都科龍化工廠產品；乙腈和甲醇（色譜純）：美國Scharlau化學試劑有限公司產品；CDCl3：青島龍微波技術有限公司產品；水為去離子水；其他試劑均為分析純或更高純度。

1.3 脯氨酸有機催化劑的合成

將120mL CF3CO2H加入干燥潔凈的500 mL圓底燒瓶中，并放在冰浴中。32.75g（250 mmol）粉狀羥基脯氨酸在70～75℃下干燥24h后，緩慢加入反應瓶中，劇烈攪拌，形成粘性溶液（脯氨酸有小部分沒有溶解）。混合物反應15 min后，從冰浴中取出，室溫攪拌5min，將1.5倍摩爾比的酰氯緩慢加入反應瓶中，室溫下繼續攪拌6h，得到無色透明溶液[13，16－18]。吸取 100 μL反應液加入900μL乙腈稀釋，取5μL反應稀釋液通過高效液相自動進樣，分離。對產物的相對分子質量和結構進行質譜測定。

將反應6h后的反應燒瓶放在冰浴中冷卻，劇烈攪拌20min后，加入360mL乙醚，先緩慢、后加快速度。產生的白色懸浮液在0～5℃下攪拌15min后，減壓過濾。乙醚潤洗2次，通風櫥內室溫干燥23h，得到干燥的細白粉末狀的O－酰基－4－羥基脯氨酸鹽。經此方法洗滌的樣品純度較高，可直接進行核磁分析，反應機理示于圖1。

圖1 脯氨酸有機催化劑的反應機理Fig.1 The mechanism of the reaction

1.4 LC/MS條件

1.4.1 色譜條件 采用自動進樣器進樣；色譜柱：Gemini－C18柱（150×4.6mm×5mm）；進樣量：5mL；柱溫：30℃；流動相為V（乙腈）∶V（5mmol/L甲酸溶液）＝40∶60）的混合溶液；流速0.2mL/min；運行時間15min。

1.4.2 質譜條件 毛細管電壓3 500V，噴霧器25MPa，干燥氣體流速10L/min，干燥氣體溫度350℃，質譜掃描范圍m/z 15～1 000。串聯質譜參數列于表1。

表1 分析物串聯質譜參數Table 1 Tandem mass spectrometry parameters for the targets

2 結果與討論

2.1 通過正交試驗優化脯氨酸有機催化劑的合成

為了找到合成脯氨酸有機催化劑的最佳條件，應用水平正交試驗，這不僅可以研究獨立變量對反應的影響，也可以確定每一個因素對反應影響的強弱關系[19－20]。

試驗中，根據反應時間（A），底物摩爾比（B）和溫度（C）3個因素對反應效率的影響，設定了3因素6水平的正交試驗。在測定結果中，k是O－酰基－反式－4－羥基脯氨酸的分子離子峰面積的總和，結果列于表2。通過比較各水平的k值，可以確定反應的最佳條件。R＝max｛k1，k2，…，kn｝－min｛k1，k2，，…kn｝，R 代表各因素對反應的影響。高R值的變量，意味著這個變量對結果的影響更強，結果列于表3。

分析結果得到合成的最佳反應條件為A2B4C5，各因素對反應的強弱影響為：C＞B＞A。因此，將1.5倍摩爾比的酰氯加入反－4－羥基脯氨酸中，讓它們在室溫下反應6h，即為合成的最佳條件。

表2 正交試驗因素表Table 2 Orthogonal factors

表3 正交試驗數據處理與直觀分析結果（n＝3）Table 3 Experimental arrangement and results of activity of reaction time，mole ratio of substrates and temperature（n＝3）

2.2 合成的脯氨酸有機催化劑分子的分子質量和結構測定

MS/MS是在分子質量和物質結構驗證方面有用的工具之一。質譜作為結構的重要儀器，同時具備了準確、快速、靈敏的優點。O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯和O－酰基－4－羥基脯氨酸戊烷的結構分別示于圖2，圖3。二者的質譜圖分別示于圖4，圖5。

M1（O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯）：

MS：＋MS：圖3b中，283.5 [M＋Na]，261.5[M＋1]；

MS2：圖3c中，243.3[M－H2O]，215.3[M－COOH]，130.5[M－O－酰基－4－羥基脯氨酸]＋。圖3c中的碎片質量同圖3d中斷鍵部位的質量片段完全成一一對應關系。以上數據充分證明了圖3a中1號出峰物即為O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯。

圖2 O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯的結構圖Fig.2 The structure of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel styrene

圖3 O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯的質譜圖Fig.3 MS of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel styrene

圖4 O－酰基－4－羥基脯氨酸戊烷的結構圖Fig.4 The structure of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel pentane

M2（O－酰基－4－羥基脯氨酸戊烷）：

MS：＋MS：251.5[M＋Na]，229.5[M＋1]；

MS2：183.5[M－COOH]，131.5[O－酰基－反式－4－羥基脯氨酸]＋。這些質譜數據亦能充分證明圖5a中2號出峰物即為O－酰基－4－羥基脯氨酸戊烷。

脯氨酸有機催化劑在二級質譜中的斷鍵過程示于圖6。

圖5 O－酰基－4－羥基脯氨酸戊烷的質譜圖Fig.5 MS of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel pentane

為了使測定的結果更加可信，采用核磁共振法來驗證實驗中合成的材料結構。

O－酰基－4－羥基脯氨酸苯乙烯：

圖6 脯氨酸有機催化劑在二級質譜中的斷鍵過程Fig.6 The bond breaking process of proline organic catalyst in the secondary mass

O－酰基－4－羥基脯氨酸戊烷：

通過以上質譜譜圖、數據同氫譜（1HNMR）以及碳譜（13C）提供的信息對比分析，表明試驗所得的產品即為需要的脯氨酸有機催化劑。質譜分析結果也能充分證明物質的組成和結構，液質聯用的結構分析準確、靈敏，方法快速、經濟。

2.3 優化色譜分離

甲酸濃度對色譜分離有較大的影響。配制了一系列濃度分別為1、2、4、5、7、10mmol/L的甲酸溶液進行了研究。結果表現，當甲酸濃度為5mmol/L，可以實現最好的色譜分離。這種現象可以認為色譜分離的目標底物自身是一種弱酸性物質。此外，甲酸還可以增強底物在質譜中的電離能力，對試驗是非常有幫助的。因此，試驗采用5mmol/L甲酸水溶液作為流動相的水相。

3 結論

兩個O－酰基－4－羥基脯氨酸有機催化劑在高效液相色譜－串聯質譜法建立的正交試驗優化條件下進行了合成。高效液相色譜法的快速高效分離，MS/MS對產物的相對分子質量和結構的高靈敏度和高選擇性的檢測鑒定，為實驗研究節約了大量時間。正交試驗試驗了各因素對反應效率的影響，表明了各因素對反應影響強度的強弱，也為試驗找到了最佳的反應條件：將1.5倍摩爾比的酰氯加入反－4－羥基脯氨酸中，在室溫下反應6h。同時，高效液相色譜－串聯質譜法能快速、準確地鑒定產物及其純度，并對反應機理做進一步解釋。該方法簡便、易行，是一種省時、經濟、有效的研究方法和分析手段，可用于有機反應監控和產物分析，也是高效液相色譜－串聯質譜應用的拓展。

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