液相色譜－高分辨質(zhì)譜在獸藥殘留分析中的應(yīng)用進(jìn)展

夏 曦，李曉薇，丁雙陽(yáng)，沈建忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

液相色譜－高分辨質(zhì)譜在獸藥殘留分析中的應(yīng)用進(jìn)展

夏 曦，李曉薇，丁雙陽(yáng)，沈建忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

液相色譜－高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）技術(shù)在獸藥殘留分析領(lǐng)域的研究已經(jīng)顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿Α１疚年U述了LC-HRMS技術(shù)的特點(diǎn)，并總結(jié)了近幾年來(lái)LC-HRMS在獸藥多殘留篩選分析中的應(yīng)用實(shí)例，展望了LC-HRMS技術(shù)的發(fā)展前景。應(yīng)用高分辨質(zhì)譜的全掃描和精確質(zhì)量測(cè)定功能，結(jié)合超高效液相色譜技術(shù)，優(yōu)化樣品前處理方法，可以實(shí)現(xiàn)100多種獸藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。與四極桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜的參數(shù)設(shè)定簡(jiǎn)單，并適用于非定向和未知化合物的篩選，需要增加目標(biāo)化合物時(shí)，不必再次處理樣品和進(jìn)樣，重新分析已有的全掃描數(shù)據(jù)即可。UHPLC-HRMS作為最有潛力的分析技術(shù)，仍有很大的發(fā)展空間，TOF的分辨率和Orbitrap的掃描速度有待提高，簡(jiǎn)便易用的數(shù)據(jù)處理軟件也需要完善。

獸藥殘留；液相色譜；高分辨質(zhì)譜

食品安全已經(jīng)引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注，其中獸藥殘留是影響動(dòng)物源性食品安全的主要因素之一。在畜牧養(yǎng)殖上，各種抗生素、激素等藥物不但被用于動(dòng)物疾病的治療，同時(shí)還添加到動(dòng)物日糧或飲水中用于非治療性的目的，主要表現(xiàn)為發(fā)病率及死亡率的下降、促生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善產(chǎn)品品質(zhì)等效果。這些藥物的過(guò)量和違禁使用不可避免的產(chǎn)生了獸藥殘留。獸藥殘留的危害嚴(yán)重，會(huì)引起敏感人群的中毒反應(yīng)，可能導(dǎo)致各種慢性、蓄積毒性，長(zhǎng)期低劑量用藥還容易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。因此，加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控已是刻不容緩的事情。

常用的獸藥有10多類，上百種，同時(shí)檢測(cè)多類獸藥是殘留分析工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)。現(xiàn)階段，高通量的篩選結(jié)合準(zhǔn)確的確證是廣泛采用的獸藥殘留檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒是最常用的篩選方法，一次能夠檢測(cè)至少幾十個(gè)樣品，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，其缺點(diǎn)是一種試劑盒只能針對(duì)一種藥物，而且無(wú)法避免假陽(yáng)性。目前，色譜－質(zhì)譜聯(lián)用是唯一有效的殘留檢測(cè)確證技術(shù)。單四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜運(yùn)用選擇離子掃描（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式，具有極高的靈敏度和選擇性，氣相色譜－質(zhì)譜（GC/MS）和 液 相 色 譜－三 重 四 極 桿 質(zhì) 譜（LC-QqQ-MS）被廣泛用于確證檢測(cè)［1－4］。同時(shí)，LC-QqQ-MS也被用于已知化合物的篩選，但是當(dāng)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)化合物時(shí)，為了保證每個(gè)MRM通道的駐留時(shí)間，需要根據(jù)化合物的色譜保留時(shí)間分段設(shè)定參數(shù)，能夠同時(shí)檢測(cè)的化合物數(shù)量有一定的限制。如果要進(jìn)行未知化合物的篩選，則需要全掃描模式采集數(shù)據(jù)，單位分辨的四極桿質(zhì)譜在全掃描模式下的靈敏度很差，不能滿足殘留分析的要求。

與低分辨質(zhì)譜不同，高分辨質(zhì)譜（HRMS）（如飛 行 時(shí) 間 質(zhì) 譜 （TOF-MS）、軌 道 阱 質(zhì) 譜（Orbitrap-MS）等）能夠提供高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量分辨率的全掃描數(shù)據(jù)。液相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（LC-HRMS）能夠提取目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量色譜圖，理論上可以分析的化合物沒(méi)有數(shù)量限制。如果需要增加新的目標(biāo)化合物，HRMS的全掃描數(shù)據(jù)還可以隨時(shí)進(jìn)行重新處理。儀器方法的設(shè)定也相對(duì)簡(jiǎn)單，不會(huì)因?yàn)槟繕?biāo)化合物的增加而損失靈敏度。在實(shí)際應(yīng)用中，研究人員已經(jīng)建立了能夠同時(shí)檢測(cè)上百種獸藥的方法，顯示了LC-HRMS法在獸藥殘留篩選方面的巨大潛力。本工作總結(jié)了近年來(lái)的研究結(jié)果，綜述了LC-HRMS的發(fā)展及其在獸藥殘留分析中的應(yīng)用。

1 液相色譜－高分辨質(zhì)譜的發(fā)展

液相色譜能夠用于分析幾乎所有的獸藥，但是如果要一次分析多種藥物，如進(jìn)行多類化合物的篩選，色譜運(yùn)行的時(shí)間會(huì)相對(duì)較長(zhǎng)。液相色譜的分離度不如氣相色譜，需要優(yōu)化梯度洗脫來(lái)獲得適當(dāng)?shù)姆蛛x，尤其是獸藥殘留需要檢測(cè)的動(dòng)物組織樣品成分復(fù)雜，由色譜的共流出物引起的基質(zhì)效應(yīng)幾乎不可避免，分離度越好，越可以有效降低離子抑制效應(yīng)。研究人員一直期望能夠同時(shí)提高液相色譜的分離度和分析速度。區(qū)別于傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC），超高效液相色譜（UHPLC）的出現(xiàn)使人們看到了希望，其解決分離度和速度的途徑有以下幾種：1）提高柱溫以降低流動(dòng)相的粘度和極性；2）用整體柱替代顆粒填充柱；3）使用小顆粒填料［5－7］。目前，應(yīng)用最廣泛的是亞2μm顆粒填料技術(shù)，自問(wèn)世以來(lái)已有600篇以上相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。總體來(lái)說(shuō)，UHPLC可以保持在原有的或更好的分離度下，提高3～5倍分析速度，并增加峰容量［8－10］。

常見(jiàn)的高分辨質(zhì)譜包括磁質(zhì)譜、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR-MS）和 TOF-MS等，其中磁質(zhì)譜和FT-MS的購(gòu)買、運(yùn)行和維護(hù)價(jià)格昂貴，操作繁瑣，分析速度較慢，不適合于獸藥殘留的常規(guī)檢測(cè)，因此不做詳述。TOF-MS能夠達(dá)到5ppm的質(zhì)量精度和較快的采樣速度（10次/秒），被越來(lái)越多的應(yīng)用于獸藥殘留的篩選分析。TOF-MS一直以來(lái)受人詬病的主要問(wèn)題是動(dòng)態(tài)范圍較小，影響精確質(zhì)量的測(cè)定和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)化合物的濃度過(guò)高，檢測(cè)器由于信號(hào)溢出不能測(cè)定其精確質(zhì)量，動(dòng)態(tài)范圍增強(qiáng)（DRE）功能的出現(xiàn)能有效地解決這一問(wèn)題。開(kāi)啟DRE功能時(shí)，如果檢測(cè)到大量的某個(gè)離子，儀器會(huì)切換到低靈敏度的模式以測(cè)定其精確質(zhì)量，并根據(jù)放大因子校正響應(yīng)值。Leandro等［11］比較了是否應(yīng)用DRE對(duì)精確質(zhì)量測(cè)定的區(qū)別，測(cè)試的藥物濃度為1.0mg/L，如果關(guān)閉DRE，獲得的質(zhì)譜圖顯示信號(hào)飽和，質(zhì)量誤差為14mu，而應(yīng)用DRE后，質(zhì)量誤差小于1mu。隨著TOF-MS離子光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化，檢測(cè)器的設(shè)計(jì)運(yùn)用了高速模擬數(shù)字轉(zhuǎn)化技術(shù)（ADC），使TOF-MS從根本上獲得了更寬的動(dòng)態(tài)范圍，在同時(shí)檢測(cè)低濃度和高濃度化合物時(shí)更為精確。

LC-TOF-MS的精確質(zhì)量測(cè)定在復(fù)雜樣品檢測(cè)中有很好的選擇性和靈敏度，同時(shí)也需要保證足夠的質(zhì)譜分辨率，否則在篩選時(shí)容易出現(xiàn)假陰性［12］。文獻(xiàn)中的TOF-MS基本上都能達(dá)到5ppm的質(zhì)量精度和最高15 000FWHM的分辨率，但在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)仍會(huì)稍顯不足。Orbitrap-MS是一種結(jié)合靜電場(chǎng)離子阱和快速傅里葉變換技術(shù)的新型質(zhì)譜，2000年首次報(bào)道［13］，并迅速得到商品化應(yīng)用。Orbitrap臺(tái)式質(zhì)譜擁有100 000FWHM的分辨率和2～5 ppm的質(zhì)量精度，成功的把FT-MS小型化，在檢測(cè)獸藥殘留時(shí)可以降低復(fù)雜背景的干擾。但是，Orbitrap-MS的高分辨率會(huì)犧牲掃描速度，在與UHPLC聯(lián)用時(shí)遇到了瓶頸。UHPLC的峰寬一般為2～5s，因此質(zhì)譜的速度至少需要達(dá)到5Hz，每個(gè)色譜峰才能采集到足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)，而Orbitrap-MS在此情況下的分辨率沒(méi)有優(yōu)勢(shì)可言。不過(guò)Orbitrap-MS的發(fā)展很快，相信掃描速度更快的儀器不久將會(huì)問(wèn)世。

2 液相色譜－高分辨質(zhì)譜在獸藥殘留分析中的應(yīng)用

多類藥物的篩選方法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中早已得到廣泛應(yīng)用［14－15］，而在獸藥殘留分析中才逐漸興起。不同種類的獸藥理化性質(zhì)差別較大，同時(shí)分離純化多類藥物的前處理比較困難，檢測(cè)不同動(dòng)物基質(zhì)中獸藥殘留的方法也具有各自的特點(diǎn)。

2.1 尿液中獸藥殘留的檢測(cè)

很多藥物經(jīng)腎臟排出體外，在尿液中的殘留量通常很高，文獻(xiàn)中已有大量檢測(cè)尿液中獸藥殘留方法的報(bào)道［16－19］。藥物在尿液中大多不是游離狀態(tài)，而且經(jīng)常與內(nèi)源性的小分子（如葡萄糖醛酸、硫酸等）形成軛合物，這為尿液中獸藥殘留的檢測(cè)增加了難度，需要進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的酶解反應(yīng)后才能有效地提取藥物。活體動(dòng)物的尿液采集非常困難，屠宰時(shí)動(dòng)物受到驚嚇產(chǎn)生排尿反應(yīng)，膀胱中剩余的尿液已很少，不論是方法學(xué)建立時(shí)空白對(duì)照尿液的來(lái)源，還是實(shí)際樣品的采集都不易解決。

Touber等［20］建立了牛尿中22種藥物的UHPLC-TOF-MS檢測(cè)方法，其中包括17種糖皮質(zhì)激素、類固醇以及β－受體激動(dòng)劑。以含0.1%甲酸的水和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，整個(gè)色譜運(yùn)行時(shí)間為5.5min。UHPLC的分離效果很好，其中作為同分異構(gòu)體的地塞米松和倍他米松都得到分離。TOF-MS的分辨率為10 000FWHM，每個(gè)化合物可以提取50mu質(zhì)量精度的質(zhì)量色譜圖，糖皮質(zhì)激素的質(zhì)量誤差在6ppm之內(nèi)。牛尿中方法的檢出限（LOD）為0.1～3.3μg/L，定量限（LOQ）為0.4～4.4 μg/L。該方法可以很容易的擴(kuò)展到別的違禁藥物，當(dāng)添加另外21種β－受體激動(dòng)劑時(shí)，對(duì)原有藥物的檢測(cè)沒(méi)有影響。

Kaufmann等［21］認(rèn)為 UHPLC-TOF-MS是獸藥殘留篩選的新手段，并建立了檢測(cè)尿液中上百種獸藥的方法，包括喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類、頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類、苯并咪唑類、鎮(zhèn)靜劑類、四環(huán)素類以及孔雀石綠等藥物。尿樣經(jīng)過(guò)稀釋后不用處理直接進(jìn)樣，單次進(jìn)樣的梯度洗脫總時(shí)間為7.5min，顯示了極高的樣品通量。該方法開(kāi)發(fā)時(shí)使用的是常規(guī)5μm顆粒色譜柱的HPLC，進(jìn)樣量為20μL，一般在分析120個(gè)樣品后，由于質(zhì)譜接口受到基質(zhì)的干擾靈敏度會(huì)降低。最終采用了1.7μm的UHPLC，進(jìn)樣量減少為5μL，能有效的克服靈敏度下降的問(wèn)題。90%以上藥物的LOQ都低于10μg/L，LOQ值最高的乙酰磺胺和洛硝噠唑?yàn)?5μg/L。提取精確質(zhì)量的色譜圖可以減少背景的干擾，但是如果提取色譜圖的窗口太窄，則會(huì)丟失目標(biāo)化合物，因此精確質(zhì)量的窗口應(yīng)該根據(jù)儀器的分辨率來(lái)選擇。對(duì)于尿樣中藥物的確證，檢測(cè)到其代謝物是強(qiáng)有力的證據(jù)，但是一般這些代謝物難以獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)照，而運(yùn)用TOF-MS的精確質(zhì)量測(cè)定和元素組成分析對(duì)代謝物的定性有很大幫助。

Stolker 等［22］同時(shí)運(yùn)用LC-QqQ-MS 和LC-QTOF-MS檢測(cè)牛尿中的皮質(zhì)激素，并對(duì)兩種技術(shù)的定性定量分析結(jié)果進(jìn)行比較。研究中所用的三重四極桿和飛行時(shí)間質(zhì)譜分別為Quattro Ultima和Ultima API，二者均能滿足獸藥殘留檢測(cè)的要求。其中LC-QTOF-MS在定性分析方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，一次進(jìn)樣的質(zhì)譜圖就可以定性；而LC-QqQ-MS有時(shí)則需要二次進(jìn)樣，并且LC-QTOF-MS的精確質(zhì)量測(cè)定能夠有效提高質(zhì)量色譜圖的選擇性，排除干擾。在方法學(xué)的驗(yàn)證方面（如線性范圍和重現(xiàn)性等），LC-QqQ-MS和 LC-QTOF-MS的性能相似，LC-QqQ-MS僅在靈敏度上比LC-QTOF-MS更好。

2.2 毛發(fā)中獸藥殘留的檢測(cè)

很多獸藥和激素在動(dòng)物組織內(nèi)的消除速度很快，為監(jiān)控違禁添加物的濫用增加了難度。區(qū)別于肉、肝、腎等組織，毛發(fā)樣品可以活體采集，不會(huì)引起動(dòng)物的死亡或疼痛，運(yùn)輸和保存也較為容易。更為重要的是，很多藥物在毛發(fā)中殘留的含量高于肉、肝、腎等組織，消除趨勢(shì)也很緩慢［23－26］。在檢測(cè)同化激素、β－受體激動(dòng)劑等藥物殘留時(shí)，選擇毛發(fā)作為檢測(cè)的靶組織值得推廣。但是，毛發(fā)樣品作為靶組織的問(wèn)題在各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制有一定困難，難以確定目標(biāo)化合物是否完全被提取出來(lái)，也不易區(qū)分陽(yáng)性樣品確實(shí)是藥物殘留還是由毛發(fā)的外部污染造成的［27］。

Van der Heeft等［28］運(yùn)用UHPLC-TOF-MS和UHPLC-Orbitrap-MS進(jìn)行牛毛中激素殘留的全掃描精確質(zhì)量測(cè)定，TOF和Orbitrap的型號(hào)分別為L(zhǎng)CT Premier TOF MS和LTQ Orbitrap XL MS。空白對(duì)照的牛毛樣品經(jīng)過(guò)清洗、干燥后，剪碎為1cm左右的小段，再進(jìn)行粉碎。毛發(fā)經(jīng)磷酸鹽緩沖液振蕩提取后，加入甲醇并離心。上清液加入純水稀釋，然后用Bond Elut固相萃取柱凈化，洗脫液干燥后用甲醇－乙腈－水溶液復(fù)溶，并添加14種類固醇。UHPLC-Orbitrap-MS在分辨率為60 000FWHM時(shí)，能夠檢測(cè)到全部的低濃度（ng/g）添加的藥物，并且質(zhì)量誤差小于3ppm。對(duì)于毛發(fā)樣品的分析，質(zhì)量誤差要小于5ppm，提取的質(zhì)量色譜圖才能有效地排除基質(zhì)本底的干擾。當(dāng)UHPLC-TOF-MS的分辨率為10 000FWHM或者UHPLC-Orbitrap-MS的分辨率只有7 500FWHM時(shí)，就不能檢測(cè)到所有添加的化合物。為了降低檢測(cè)的假陰性率，在進(jìn)行復(fù)雜樣品的精確質(zhì)量測(cè)定時(shí)，必須保證質(zhì)譜的高分辨率。

2.3 牛奶中獸藥殘留的檢測(cè)

牛奶的營(yíng)養(yǎng)豐富，奶制品在人民的膳食結(jié)構(gòu)中占有重要地位，牛奶中的獸藥殘留一直是監(jiān)控的重點(diǎn)。集約化飼養(yǎng)的奶牛極易發(fā)生乳房炎等疾病，用藥不當(dāng)或者沒(méi)有嚴(yán)格執(zhí)行休藥期就會(huì)導(dǎo)致牛奶中的藥物殘留。Stolker等［29］建立了牛奶中101種化合物的定量篩選方法，覆蓋了苯并咪唑、大環(huán)內(nèi)酯、β－內(nèi)酰胺、喹諾酮、磺胺、吡啶、四環(huán)素、硝基咪唑、鎮(zhèn)靜劑、非甾體類抗炎藥、離子載體和氯霉素等12類藥物。樣品經(jīng)乙腈提取和蛋白沉淀后，用Strata X固相萃取柱凈化，然后用UHPLC-TOF-MS測(cè)定。采集全掃描的數(shù)據(jù)，根據(jù)每個(gè)藥物的相對(duì)分子質(zhì)量提取精確質(zhì)量色譜圖進(jìn)行定性定量分析。按照歐盟法規(guī)中對(duì)定量篩選方法的要求驗(yàn)證方法學(xué)性能，在最高殘留限量的濃度水平，86%目標(biāo)化合物的重復(fù)性低于20%，96%目標(biāo)化合物的重現(xiàn)性低于40%，88%目標(biāo)化合物的回收率在80%～120%之間，方法的靈敏度和線性范圍也符合定量方法的標(biāo)準(zhǔn)。該方法能夠準(zhǔn)確的分辨疑似樣品和陰性樣品，判斷藥物含量是否超過(guò)最高殘留限量。在運(yùn)用該方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，分析了100份牛奶樣品，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品，只是檢驗(yàn)出了含有磺胺的質(zhì)量控制樣品。

為了提高樣品的分析速度，Ortelli等［30］運(yùn)用超濾離心技術(shù)簡(jiǎn)化樣品前處理步驟，每天可以分析50個(gè)樣品。牛奶樣品加入乙腈沉淀蛋白，經(jīng)17 000g離心后，吸出上清液轉(zhuǎn)移至3kD的超濾離心管中，再用17 000g離心60min，進(jìn)一步清除提取溶液中的大分子物質(zhì)。超濾后的提取液經(jīng)濃縮蒸發(fā)乙腈，這樣就完成了樣品的制備。該方法能夠篩選150種常見(jiàn)的獸藥及其代謝物，LOD在0.5～25μg/L之間，遠(yuǎn)低于大部分藥物的最高殘留限量。乙腈沉淀蛋白結(jié)合超濾離心的方法比固相萃取法要快很多，基質(zhì)效應(yīng)也嚴(yán)重一些，不過(guò)不同來(lái)源的牛奶樣品引起的基質(zhì)效應(yīng)基本一致，只有非班太爾和紅霉素受到的影響隨不同的樣品而變化較大。喹諾酮類藥物顯示了離子增強(qiáng)效應(yīng)，其中恩諾沙星增強(qiáng)了1 300%。在進(jìn)行實(shí)際樣品驗(yàn)證時(shí)，所有的陰性樣品與ELISA的結(jié)果相同，而檢測(cè)到含有喹諾酮類藥物的疑似陽(yáng)性樣品與ELISA有區(qū)別。

2.4 組織中獸藥殘留的檢測(cè)

Hermo等［31］應(yīng)用LC-TOF-MS（型號(hào)：MSD Sciex MassHunter TOF MS）檢測(cè)豬肝中8種喹諾酮類藥物的多殘留方法，并在方法性能上與LC-Q-MS（LC-quadrupole-MS）和 LC-QqQ-MS（型號(hào)：PE Sciex API3000）進(jìn)行比較。LC-TOF-MS方法的定量限能達(dá)到1.5～6 μg/kg，所有喹諾酮的回收率均在60%以上，檢測(cè)限低于2μg/kg，在靈敏度、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度方面都能滿足獸藥殘留檢測(cè)的要求。LC-TOF-MS的靈敏度介于LC-Q-MS 和LC-QqQ-MS之間，其LOQ值比LC-Q-MS的低1～4倍，但比LC-QqQ-MS的高1.5～6倍。不論是LC-TOF-MS和LC-QqQ-MS方法，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，個(gè)別目標(biāo)化合物高濃度點(diǎn)（250～300μg/kg）的響應(yīng)值會(huì)影響曲線的相關(guān)性。LC-TOF-MS較 LC-QqQ-MS的優(yōu)點(diǎn)在于化合物精確質(zhì)量的測(cè)定。當(dāng)運(yùn)用LC-QqQ-MS分析惡喹酸和氟甲喹時(shí)，這兩個(gè)化合物的準(zhǔn)分子離子都是m/z262，有相同的碎片離子m/z244，色譜的保留時(shí)間也相同；而用LC-TOF-MS檢測(cè)時(shí)，分別提取m/z262.071 0和m/z262.087 4就能夠?qū)⒍邊^(qū)別開(kāi)來(lái)。

同樣是應(yīng)用LC-TOF-MS檢測(cè)喹諾酮類藥物的殘留，Zheng等［32］研究了固相微萃取技術(shù)純化牛奶、雞蛋、雞肉和魚(yú)肉中7種喹諾酮的方法。樣品提取后，經(jīng)在線固相微萃取凈化并直接進(jìn)行LC-TOF-MS分析。在雞蛋、牛奶、雞肉、魚(yú)肉中，7種喹諾酮的 LOD分別為0.3～1.2 μg/kg、0.2～3.0μg/L、0.2～0.7μg/kg、0.2～1.0μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.995以上。在4種不同基質(zhì)中，喹諾酮的回收率在80～115%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于14.5%。該方法結(jié)合內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，回收率較好，但是選擇氧氟沙星作為內(nèi)標(biāo)較為不妥，因?yàn)樵趯?shí)際樣品中可能有氧氟沙星的殘留而影響定量結(jié)果。

經(jīng)反相液相色譜分離后，Carrasco-Pancorbo等［33］運(yùn)用紫外和TOF-MS檢測(cè)蜂蜜中8種四環(huán)素。不同的藥物在正離子和負(fù)離子模式下靈敏度不一致，但是產(chǎn)生的主要碎片離子都是脫水和/或脫氨基形成的。在負(fù)離子模式下，8種四環(huán)素的LOD為0.05～0.76μg/kg，優(yōu)于已有的報(bào)道，能夠分析的四環(huán)素藥物種類也最多。添加回收實(shí)驗(yàn)的濃度為10～100μg/kg，回收率在72%～91%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)7%。在LOQ濃度附近時(shí)，檢測(cè)到的四環(huán)素類藥物的質(zhì)量偏差基本上在5ppm以下。該文指出，單獨(dú)依靠高精確質(zhì)量（＜1ppm）難以有效確定化合物，結(jié)合同位素豐度比進(jìn)行過(guò)濾，才能把幾千種可能的化合物減少為幾種候選化合物。

Hernando等［34］報(bào)道了檢測(cè)鮭魚(yú)中3種喹諾酮、紅霉素、孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠、埃瑪菌素的LC-TOF-MS方法。樣品前處理采用固液萃取的方法，回收率高于80%，恩諾沙星的回收率偏低，只有40%左右。在最高殘留限量濃度附近進(jìn)行精密度測(cè)定時(shí)，批內(nèi)和批間變異系數(shù)為2%～15%。方法的LOD為1～3 μg/kg，LOQ為3～9μg/kg，遠(yuǎn)低于這些藥物的最高殘留限量，但是孔雀石綠和隱色孔雀石綠的LOQ分別為2μg/kg和1μg/kg，高于歐盟法規(guī)中最低要求執(zhí)行限（MRPL）的標(biāo)準(zhǔn)（孔雀石綠和隱色孔雀石綠二者之和為2μg/kg）。該方法的線性范圍從LOQ到600μg/kg，相關(guān)系數(shù)大于0.999。TOF-MS能夠增強(qiáng)方法的選擇性，當(dāng)提取質(zhì)量色譜圖的質(zhì)量窗口由0.2u變?yōu)?.01u時(shí)，可以把孔雀石綠的基質(zhì)干擾消除。同時(shí)，目標(biāo)化合物的信噪比也從31提高到120，但是繼續(xù)縮小質(zhì)量范圍至0.001u時(shí)，靈敏度變化不大。

關(guān)于高通量的獸藥殘留前處理方法的文獻(xiàn)較少，分析動(dòng)物組織比處理尿液和牛奶等液體樣品的難度更大，Kaufmann等［35］優(yōu)化了肉、肝、腎等組織中100多種獸藥殘留的提取和純化方法。提取液為乙腈和Mcllvaine緩沖溶液，加入硫酸銨使乙腈和水相提取液分層。乙腈可以沉淀蛋白，提取的雜質(zhì)較少，緩沖溶液能夠有效地提高極性化合物（如四環(huán)素類、青霉素類）的提取效率，并且有機(jī)相和水相分離有利于濃縮，降低乙腈在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)引起的損失。提取液經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)一步凈化，單獨(dú)使用乙腈洗脫時(shí)，一些極性很強(qiáng)的青霉素類藥物難以洗脫下來(lái)。該方法分兩步洗脫，先用乙腈洗脫下大部分的目標(biāo)化合物，并使固相萃取柱上吸附的蛋白變性，然后再用乙腈緩沖液洗脫，提高極性化合物的回收率，效果很好。在樣品前處理的復(fù)溶、轉(zhuǎn)移等步驟中，使用二甲基亞砜可以提高非極性化合物的回收率。在用 UHPLC-TOF-MS測(cè)定時(shí)，Kaufmann等認(rèn)為ADC和DRE等技術(shù)已經(jīng)顯著改善了TOF-MS的動(dòng)態(tài)范圍，而選擇性是TOF-MS的主要局限，在分析復(fù)雜樣品中低質(zhì)量的化合物時(shí)問(wèn)題尤為突出，需要注意儀器的分辨率和質(zhì)量軸穩(wěn)定性。該文同時(shí)提出，快速實(shí)用的數(shù)據(jù)處理軟件也有待開(kāi)發(fā)，因?yàn)樵诜治雒總€(gè)樣品的數(shù)據(jù)時(shí)，必須提取上百種化合物的精確質(zhì)量色譜圖并進(jìn)行判斷，工作量很大。雖然TOFMS的分辨率達(dá)到12 000FWHM（LCT Premier TOF MS），在分析肝臟樣品時(shí)干擾很多，并且不能適用于蜂蜜樣品，因此考慮應(yīng)用分辨率更高的Orbitrap-MS（Orbitrap Exactive HCD）代 替TOF-MS，卻發(fā)現(xiàn)Orbitrap-MS的離子抑制非常嚴(yán)重，有些化合物甚至檢測(cè)不到［36］。造成這種現(xiàn)象的原因是離子源后起離子聚焦作用的C-trap捕捉到大量基質(zhì)中的多電荷蛋白質(zhì)而過(guò)飽和，引起低質(zhì)量離子的損失。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Kaufmann等重新優(yōu)化樣品前處理方法，更徹底地沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，并使用填料顆粒孔徑更小的固相萃取柱。優(yōu)化后的方法能夠檢測(cè)肌肉、肝臟、腎臟、魚(yú)肉和蜂蜜中100多種獸藥殘留，線性范圍、精密度、靈敏度均優(yōu)于原來(lái)的TOF-MS方法，除了前處理方法的改進(jìn)外，Orbitrap-MS提供的50 000FWHM分辨率和出色的質(zhì)量穩(wěn)定性也發(fā)揮了重要作用。

Peters等［37］建立了肉、魚(yú)、雞蛋中100種獸藥的UHPLC-TOF-MS檢測(cè)方法，在方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)有所改進(jìn)，需要制備的樣品量少于原有樣品量的1/2。樣品用V（乙腈）∶V（水）＝6∶4的溶液提取，用Strata X固相萃取柱凈化，洗脫時(shí)肌肉和魚(yú)肉樣品用V（甲醇）∶V（乙腈）＝1∶1的溶液洗脫，而雞蛋樣品需要V（甲醇）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1的溶液才能有效地將吸附的藥物洗脫。在4～400μg/kg濃度范圍內(nèi)，目標(biāo)化合物的平均質(zhì)量誤差為3ppm，中值為2.5 ppm，濃度越高誤差越小，不同組織之間的差別不大。色譜的共流出物和藥物相互之間也會(huì)影響測(cè)定的精確質(zhì)量誤差，目標(biāo)化合物在雜質(zhì)和藥物較集中的階段洗脫時(shí)，測(cè)定的質(zhì)量誤差相對(duì)較大。對(duì)化合物的定性分析同時(shí)也使用了同位素匹配的方法，用SigmaFit值來(lái)判斷，SigmaFit值越小則匹配度越高。SigmaFit也是隨著濃度升高而降低的，但是不同的組織對(duì)SigmaFit有影響，基質(zhì)越復(fù)雜SigmaFit越高。SigmaFit的平均值為0.04，中值為0.01，說(shuō)明某些藥物的偏差較大。方法重復(fù)性的中值在8%～15%之間，隨著濃度升高而降低，而重現(xiàn)性的中值為15%～20%，不隨樣品和濃度的變化而變化。準(zhǔn)確度的中值為70%～100%，92%目標(biāo)化合物的線性相關(guān)系數(shù)大于0.99。

3 結(jié)論與展望

動(dòng)物源性樣品中多類獸藥的大規(guī)模篩查和定量方法是解決樣品通量、減少消耗的有效途徑。應(yīng)用高分辨質(zhì)譜的全掃描和精確質(zhì)量測(cè)定功能，結(jié)合超高效液相色譜技術(shù)，優(yōu)化樣品前處理方法，可以實(shí)現(xiàn)100多種獸藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。與四極桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜的參數(shù)設(shè)定簡(jiǎn)單，并適用于非定向和未知化合物的篩選，需要增加目標(biāo)化合物時(shí)，不必再次處理樣品和進(jìn)樣，重新分析已有的全掃描數(shù)據(jù)即可。UHPLCHRMS作為最有潛力的分析技術(shù)，仍有很大的發(fā)展空間，TOF的分辨率和Orbitrap的掃描速度有待提高，簡(jiǎn)便易用的數(shù)據(jù)處理軟件也需要完善。

［1］HO C，SIN D W M，WONG K M，et al.Determination of dimetridazole and metronidazole in poultry and porcine tissues by gas chromatography-electron capture negative ionization mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2005，530：23-31.

［2］SHEN J Z，XIA X，JAING H Y，et al.Determination of chloramphenicol，thiamphenicol，florfenicol，and florfenicol amine in poultry and porcine muscle and liver by gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2009，877：1 523-1 529.

［3］XIA X，LI X W，DING S Y，et al.Determination of 5-nitroimidazoles and corresponding hydroxyl metabolites in swine kidney by ultra-performance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2009，637：79-86.

［4］CHU P S，LOPEZ M I.Liquid chromatographytandem mass spectrometry for the determination of protein-bound residues in shrimp dosed with nitrofurans［J］.J Agric Food Chem，2005，53：8 934-8 939.

［5］WREN S A C，TCHELITCHEFF P.Use of ultra-performance liquid chromatography in pharmaceutical development［J］.J Chromatogr A，2006，1 119：140-146.

［6］GUILLARME D，NGUYEN D T T，RUDAZ S，et al.Recent developments in liquid chromatography：Impact on qualitative and quantitative performance［J］.J Chromatogr A，2007，1 149：20-29.

［7］WU N，CLAUSEN A M.Fundamental and practical aspects of ultrahigh pressure liquid chromatography for fast separations［J］.J Sep Sci，2007，30：1 167-1 182.

［8］NGUYEN D T T，GUILLARME D，RUDAZ S，et al.Fast analysis in liquid chromatography using small particle size and high pressure［J］.J Sep Sci，2006，29：1 836-1 848.

［9］YU K，LITTLE D，PLUMB R，et al.Highthroughput quantification for a drug mixture in rat plasma-a comparison of ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry with high- performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass

Spectrom，2006，20：544-552.

［10］PETROVIC M，GROS M，BARCELO D.Multiresidue analysis of pharmaceuticals in wastewater by ultra-performance liquid chromatography－quadrupole-time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2006，1 124：68-81.

［11］LEANDRO C C，HANCOCK P，F(xiàn)USSELL R J，et al.Quantification and screening of pesticide residues in food by gas chromatography-exact mass time-of-flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2007，1 166：152-162.

［12］NIELEN M W F，VAN ENGELEN M C，ZUIDERENT R，et al.Screening and confirmation criteria for hormone residue analysis using liquid chromatography accurate mass time-of-flight，F(xiàn)ourier transform ion cyclotron resonance and orbitrap mass spectrometry techniques［J］.Anal Chim Acta，2007，586：122-129.

［13］MAKAROV A.Electrostatic axially harmonic orbital trapping：A high-performance technique of mass analysis［J］.Anal Chem，2000，72：1 156-1 162.

［14］FERRER I，GARCIA-REYES J F，F(xiàn)ERNANDEZ-ALBA A.Identification and quantitation of pesticides in vegetables by liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry［J］.Trends A-nal Chem，2005，24：671-682.

［15］GARCIA-REYES J F，HERNANDO M D，MOLINA-DIAZ A，et al.Comprehensive screening of target，nontarget and unknown pesticides in food by LC-TOF-MS［J］.Trends Anal Chem，2007，26：828-841.

［16］ANTIGNAC J P，MARCHAND P，LE BIZEC B，et al.Identification of ractopamine residues in tissue and urine samples at ultra-trace level using liquid chromatography－positive electrospray tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2002，774：59-66.

［17］VAN POUCKE C，VAN PETEGHEM C.Development and validation of a multi-analyte method for the detection of anabolic steroids in bovine urine with liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2002，772：211-217.

［18］KOOTSTRA P R，ZOONTJES P W，VAN TRICHT E F，et al.Multi-residue screening of a minimum package of anabolic steroids in urine with GC-MS［J］.Anal Chim Acta，2007，586：82-92.

［19］ANDERSEN J H，HANSEN L G，PEDERSEN M.Optimization of solid phase extraction clean up and validation of quantitative determination of corticosteroids in urine by liquid chromatographytandem mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2008，617：216-224.

［20］TOUBER M E，VAN ENGELEN M C，GEORGAKOPOULUS C，et al.Multi-detection of corticosteroids in sports doping and veterinary control using high-resolution liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2007，586：137-146.

［21］KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Ultra-performance liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry （UPLCTOF）：A novel tool for multiresidue screening of veterinary drugs in urine［J］.Anal Chim Acta，2007，586：13-21.

［22］STOLKER A A M，NIESING W，F(xiàn)UCHS R，et al.Liquid chromatography with triple-quadrupole and quadrupole-time-of-flight mass spectrometry for the determination of micro-constituents-a comparison［J］.Anal Bioanal Chem，2004，378：1 754-1 761.

［23］HOOIJERINK H，LOMMEN A，MULDER P P J，et al.Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry based method for the determination of estradiol benzoate in hair of cattle［J］.Anal Chim Acta，2005，529：167-172.

［24］QIANG Z Y，SHENTU F Q，WANG B，et al.Residue depletion of ractopamine and its metabolites in swine tissues，urine，and serum ［J］.J Agric Food Chem，2007，55：4 319-4 326.

［25］ANIELSKI P，THIEME D，SCHLUPP A，et al.Detection of testosterone，nandrolone，and precursors in horse hair［J］.Anal Bioanal Chem，2005，383：903-908.

［26］DUNNETT M，LEES P.Retrospective detection and deposition of potentiated sulphonamides in equine hair by liquid chromatography［J］.Chromatographia，2004，59：S69-S78.

［27］GRATACOS M，CASTELLARI M，VALERO A，et al.Hair analysis for veterinary drug monitoring in livestock production［J］.J Chromatogr B，2006，834：14-25.

［28］VAN DER HEEFT E，BOLCK Y J C，BEUMER B，et al.Full-scan accurate mass selectivity of ultra-performance liquid chromatography combined with time-of-flight and orbitrap mass spectrometry in hormone and veterinary drug residue analysis［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2009，20：451-463.

［29］STOLKER A A M，RUTGERS P，OOSTER INK E，et al.Comprehensive screening and quantification of veterinary drugs in milk using UPLC-ToF-MS［J］.Anal Bioanal Chem，2008，391：2 309-2 322.

［30］ORTELLI D，COGNARD E，JAN P，et al.Comprehensive fast multiresidue screening of 150 veterinary drugs in milk by ultra-performance liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2009，877：2 363-2 374.

［31］HERMO M P，BARRON D，BARBOSA J.Determination of multiresidue quinolones regulated by the European Union in pig liver samples highresolution time-of-flight mass spectrometry versus tandem mass spectrometry detection［J］.J Chromatogr A，2008，1 201：1-14.

［32］ZHENG M M，RUAN G D，F(xiàn)ENG Y Q.Evaluating polymer monolith in-tube solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry for reliable quantification and confirmation of quinolone antibacterials in edible animal food［J］.J Chromatogr A，2009，1 216：7 510-7 519.

［33］CARRASCO-PANCORBO A，CASADO-TERRONES S，SEGURA-CARRETERO A，et al.Reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to ultraviolet and electrospray time-of-flight mass spectrometry on-line detection for the separation of eight tetracyclines in honey samples［J］.J Chromatogr A，2008，1 195：107-116.

［34］HERNANDO M D，MEZCUA M，SUAREZBARCENA J M，et al.Liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry for simultaneous determination of chemotherapeutant residues in salmon［J］.Anal Chim Acta，2006，562：176-184.

［35］KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Quantitative multiresidue method for about 100 veterinary drugs in different meat matrices by sub 2－μm particulate high-performance liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2008，1 194：66-79.

［36］KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Development of an improved high resolution mass spectrometry based multi-residue method for veterinary drugs in various food matrices［J］.Anal Chim Acta，2010.

［37］PETERS R J B，BOLCK Y J C，RUTGERS P，et al.Multi-residue screening of veterinary drugs in egg，fish and meat using high-resolution liquid chromatography accurate mass time-of-flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2009，1 216：8 206-8 216.

Advances on Application of Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry in Veterinary Drug Residues Analysis

XIA Xi，LI Xiao-wei，DING Shuang－yang，SHEN Jian-zhong
（National Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Liquid chromatography-high resolution mass spectrometry （LC-HRMS）has shown great potential of application in the field of veterinary drug residues analysis.This review focuses on the technical characteristics of LC-HRMS，and especially addressed its applications and prospect in the multi-residue screening of veterinary drugs.

veterinary drug residues；liquid chromatography；high resolution mass spectrometry

O 657.63

A

1004-2997（2011）06-0333-08

2011-08-19；

2011-10-14

夏 曦（1980～），男（漢族），講師，獸醫(yī)藥理毒理專業(yè)。E-mail：xxia＠cau.edu.cn

沈建忠（1963～），男（漢族），教授，獸醫(yī)藥理毒理專業(yè)。E-mail：sjz＠cau.edu.cn