HPV感染、p16蛋白表達(dá)與宮頸病變關(guān)系的研究

趙 暘 楊向紅* 羅秀波 徐 剛

（1 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽(yáng) 110004；2 中國(guó)人民解放軍第463醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽(yáng) 110042）

國(guó)際癌癥研究中心于2004年提出HPV感染是宮頸鱗癌和上皮內(nèi)瘤變發(fā)生的必要因素；沒(méi)有持續(xù)HPV感染，女性發(fā)生宮頸鱗癌的可能性幾乎為零[1,2]。p16基因是一種細(xì)胞周期中的基本基因，直接參予細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，在人類(lèi)50%腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)有p16的純合子缺失，突變，認(rèn)為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因[3]。宮頸癌發(fā)生過(guò)程中p16的表達(dá)與HPV的感染是否相關(guān)，以往研究存在爭(zhēng)議，有待于進(jìn)一步研究。本研究探討臨床患者HPV感染、p16蛋白表達(dá)與慢性宮頸炎、癌前病變及宮頸癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

取自2009年3月至2010年3月盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診活檢和住院手術(shù)切除的宮頸標(biāo)本石蠟包埋組織130例，其中慢性宮頸炎25例，CINⅠ20例，CINⅡ27，CINⅢ31例，浸潤(rùn)癌27例（鱗狀細(xì)胞癌），患者年齡21～65歲，平均40歲。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)試劑

凱普HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒、即用型鼠抗人p16單克隆抗體及二步法PV-9000試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有患者在取組織標(biāo)本前，取宮頸脫落細(xì)胞和分泌物，接受HPV檢測(cè)。采用HybriMax通過(guò)樣本DNA的提取、PCR擴(kuò)增、導(dǎo)流雜交、酶標(biāo)顯色，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，肉眼觀(guān)察判讀結(jié)果。

免疫組織化學(xué)染色：用乳腺癌作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，嚴(yán)格按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。結(jié)果判定：p16陽(yáng)性表達(dá)定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色為染色陽(yáng)性細(xì)胞。著色按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比并參考著色強(qiáng)度確定分級(jí)如下：無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為陰性（－），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)細(xì)胞數(shù)25%～50%為中度陽(yáng)性（++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），以“++～+++”為過(guò)度表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 130例宮頸脫落細(xì)胞HPV分型檢測(cè)結(jié)果

21種HPV亞型中，檢出15種常見(jiàn)的HPV亞型（檢出率為71.4%），從高到低前5種依次為HPV16（56.15%）、HPV33（10.00%）、HPV18（6.92%）、HPV58（5.38%）、HPV31（3.85%）。其余各基因型所占比例在0.77%～2.31%之間。

2.2 實(shí)驗(yàn)各組HPV感染情況

在130例宮頸病變中，HPV感染108例，感染率83.1%。各病變組的HPV感染率如下：慢性宮頸炎6/25（24%）；CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)及宮頸癌HPV感染率分別為18/20（90%）；27/27（100.0%）；31/31（100.0%）；27/27（100.0%）；HPV感染率隨宮頸病變級(jí)別上升而升高（P＜0.05）。高危-HPV的感染率為宮頸炎組28%，CINⅠ組95%，CINⅡ/Ⅲ組、宮頸癌組100%。高危-HPV陽(yáng)性率在宮頸癌和CIN各組明顯高于慢性宮頸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 實(shí)驗(yàn)各組p16的表達(dá)情況

見(jiàn)圖1、2。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，p16陽(yáng)性表達(dá)率隨著病變程度的增加，陽(yáng)性表達(dá)以中度陽(yáng)性（++）～強(qiáng)陽(yáng)性（+++）為主；在CINⅠ中為90%（18／20），在CINⅡ、CINⅢ中均100.0%表達(dá)，單因素方差分析結(jié)果，F(xiàn)值為54.651，P=0.000＜0.001，說(shuō)明四種病征的p16不同表達(dá)水平有顯著差異。

圖1 p16在CINⅠ組織中的陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)胞核均著色，p16陽(yáng)性的細(xì)胞主要位于基底細(xì)胞層(IHC×200)

圖2 p16在CINⅢ的陽(yáng)性表達(dá)，病變細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均著色，上皮全層連續(xù)性著色。（IHC×200）

2.4 CIN組和宮頸癌組p16蛋白表達(dá)與HPV感染的關(guān)系

在子宮頸癌及CIN標(biāo)本中，HPV16陽(yáng)性率越高，p16的表達(dá)強(qiáng)度越高，HPV16感染與p16的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.998）。見(jiàn)表1。

表1 HPV16感染與p16表達(dá)程度之間的關(guān)系

3 討 論

Zur Hausen于20世紀(jì)70年代末提出人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可能與宮頸癌發(fā)病有關(guān)[4]，國(guó)際癌癥研究中心于2004年提出HPV感染是宮頸鱗癌和上皮內(nèi)瘤變發(fā)生的必要因素；沒(méi)有持續(xù)HPV感染，女性發(fā)生宮頸鱗癌的可能性幾乎為零。人乳頭狀瘤病毒（HPV）與宮頸癌關(guān)系的明確，使宮頸癌成為目前所有癌癥中唯一一種病因明確、可以早期預(yù)防和治療以及徹底根除的癌癥。文獻(xiàn)報(bào)告HPV感染基因亞型分布有地域性，各地報(bào)道不一。我們通過(guò)對(duì)130例宮頸病變患者HPV的分型篩查，發(fā)現(xiàn)該人群常見(jiàn)HPV亞型是HPV16、33、18、58和31型5種，這種差異可能與復(fù)雜的地理環(huán)境、社會(huì)生物因素或宿主的遺傳免疫因素有關(guān)，值得在CIN和宮頸癌的防治策略中考慮，對(duì)宮頸癌疫苗的研制及應(yīng)用有指導(dǎo)意義。

一般認(rèn)為，90%以上的HPV感染在無(wú)任何干預(yù)的情況下可自行消退，僅有5%～10%發(fā)展為持續(xù)性的感染，只有高危型HPV的持續(xù)感染才與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。本研究在慢性宮頸炎組中，高危-HPV感染率為28%，在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌組織中，高危-HPV感染率分別為95%，100%和100%；高危-HPV感染率隨著宮頸病變級(jí)別增加，陽(yáng)性率增高。HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的主要原因，本研究數(shù)據(jù)再次證實(shí)了這個(gè)觀(guān)點(diǎn)。

近年以來(lái)，絕大多數(shù)學(xué)者的研究認(rèn)為p16可以作為宮頸上皮細(xì)胞異型的一個(gè)標(biāo)志物。如Connor認(rèn)為p16可以作為宮頸癌前病變的標(biāo)志物[5]；Kalof等也認(rèn)為p16對(duì)于診斷CIN是一個(gè)非常有用的標(biāo)志物[6]；Kales等及Sayed等的研究認(rèn)為當(dāng)p16免疫組化染色用于CIN的輔助診斷時(shí)，能夠降低觀(guān)察者之間的差異，對(duì)于提高病理學(xué)家之間診斷的一致性具有重要的作用[7,8]。本次研究，在108例HPV-DNA陽(yáng)性病例中，p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率92.3%，且隨著宮頸各組病變的HPV-DNA檢出率逐漸升高，p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)亦逐漸升高。可以看出，p16作為宮頸癌和其癌前病變的診斷性標(biāo)志及預(yù)后是很有應(yīng)用前景的。

自從1998年Sano等[9]提出p16可以作為宮頸上皮內(nèi)病變的一個(gè)診斷標(biāo)志物用于臨床病理診斷工作之中后，大部分學(xué)者的研究報(bào)道指出，p16散在點(diǎn)狀弱陽(yáng)性常預(yù)示低危型HPV感染的低級(jí)別CIN，而p16彌漫性或帶狀強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)則預(yù)示高危型HPV感染的高級(jí)別CIN[10-12]。本次研究，在108例HPV-DNA陽(yáng)性病例中，p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率92.3%，且隨著宮頸各組病變的HPV-DNA檢出率逐漸升高，p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)亦逐漸升高。HPV感染與p16蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。推測(cè)p16的高表達(dá)預(yù)示著高危HPV的感染，這就為臨床的綜合診斷及早期治療提供了依據(jù)。

綜上所述，HPV持續(xù)感染是引發(fā)宮頸病變重要病原學(xué)因素；p16蛋白表達(dá)的強(qiáng)度與CIN的分級(jí)明顯相關(guān)，可以區(qū)分低、高度CIN，因此，可以考慮將HPV病毒檢測(cè)以及分子標(biāo)志物p16聯(lián)合起來(lái)，共同監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展情況，幫助鑒別潛在的高級(jí)別的癌前期病變或子宮頸癌。

[1] Tavassoli FA,Davilee P.WHO classification of tumor.Pathology &genetics tumors of the breast and female genital organs[M].Lyon：ARC Press,2003：266.

[2] Cox JT.Human papillomavirus testing in primary cervical screening and abnormal papanicolaou management[J].Chstet Gynecol Surv,2006,61(6)：15-25.

[3] Kamb A,Cruis NA,Weaver-Feldnaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involvoed in genesis of many tumor types[J].Science,1994,264(5157)：436-440.

[4] H Zur Hausen.Viruses in human cancers[J].Science,1991,254(5035)：1167-1173.

[5] O'Connor DM.The Use of p16 as a marker for cervical cancer precursor lesions[J].J Lower Genital Tract Disease,2007,11(2)：67-68.

[6] Kalof A,Cooper K.p16INK4a immunoexpression： surrogate marker of high-risk HPV and high-grade cervical intraepithelial neoplasia[J].Adv Anat Pathol,2006,13(4)：190-194.

[7] Klaes R,Benner A,Friedrich T,et al.p16INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia[J].Am J Surg Pathol,2002,26(11)：1389-1399.

[8] Sayed K,Korourian S,Ellison D A,et al.Diagnosing cervical biopsies in adolescents： the use of p16 immunohistochemistry to improve reliability and reproducibility[J].J Lower Genital Tract Disease,2007,11(3)：141-146.

[9] Sano T,Oyama T,Kashiwabara K,et al.Immunohistochemical overexpression of p16 protein associated with intact retinoblastoma protein expression in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia[J].Pathol Int,1998,48(8)：580-585.

[10] Murphy N,Ring M,Killalea AG,et al.p16INK4A as a marker for cervical dyskaryosis：CIN and cGIN in cervical biopsies and ThinPrep smears[J].J Clin Pathol,2003,56(1)：56-63.

[11] Cuschieri KS,Cubie HA,Whitley MW,et al.Persistent high risk HPV infection associated with development of cervical neoplasia in a prospective population study[J].J Clin pathol,2005,58(9)：946-950.

[12] Ishikawa M,Fujii T,Saito M,et al.Overexpression of p16 INK4a as an indicator for human papillomavirus oncogenic activity in cervical squamous neoplasia[J].Int J Gynecol Cancer,2006,16(7)：347-353.