實時熒光PCR技術快速檢測禽流感病毒H5型探討

王七生

（桂林市疾病預防控制中心，廣西 桂林 541001）

PCR技術一直作為一種敏感性高的核酸分子檢測方法于科學研究中廣泛應用。但由于其難以進行定量檢測，同時還存在污染[1]等問題，在臨床應用中受到限制。隨著實時熒光PCR技術的引入與發展，PCR技術逐步應用于臨床病原體等檢測與診斷。考慮到H5型是國內禽流感病毒常見的血清型[2]，筆者現將實時PCR技術應用于禽流感病毒H5型檢測，以期為禽流感病毒研究提供更快速有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒菌株

禽流感病毒H5型均本研究所提供。

1.2 主要試劑及儀器

本研究所用PCR儀器為美國ABI公司生產，型號為7300。所用凝膠成像系統為美國Bio-Rad生產的Gel Doc2000。所用分光光度計為美國Varian生產的Cary50Probe紫外光度計。試劑盒包括提取RNA的試劑盒等均從Amersham Biosciences 購買。所用超速離心機為德國Eppendorf生產。本研究所用試劑TaKaRa實時PCR試劑盒等均從大連寶生物公司購買。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物及探針設計、合成

根據GenBank上禽流感H5型HA核酸序列，并結合DNASTAR軟件做同源分析，以獲得研究所需H5型HA保守核算序列，并經引物相關軟件（如Primer等）、探針相關軟件如（Oligo等）進行引物、探針設計，同時將已設計好的引物、探針交由寶生物公司合成。

1.2.2 目的基因擴增、測序、特異性檢測

先根據試劑盒方法提前RNA，并以其為模板，逆轉錄為cDNA，進一步擴增目的基因。制備陽性標準品，并進行測序以確定所獲陽性標準品為禽流感H5型HA基因。之后根據實時PCR試劑盒提供的優化方法進行退火溫度、離子濃度（主要是Mg2+）、探針濃度、引物濃度等優化，并建立標準曲線。標準曲線建立方法即：將陽性標準品置于260nm紫外光下進行吸光度測定，以計算出DNA的拷貝數。并分別連續10倍稀釋且進行熒光PCR檢測以獲得標準曲線，且經重復性、敏感性檢測。同時H5型HA基因與禽流感H7、H9、其他病毒包括ILTV、DPV、大腸菌O46進行特異性檢測。

2 結 果

2.1 引物、探針序列及特異性檢測結果

禽流感H5型HA基因引物、探針序列如表所示，基因片段150bp，與另82種禽流感H5亞型同源性達100%，高度保守。經RT-PCR擴增片段并進行測序，與預期片段基本一致（圖1），可初步證實擴增片段是目的片段。RT-PCR擴增（50μL體系）：dNTPs取2μL，上下游引物分別取1μL，聚合酶取0.5μL，PCR緩沖液取102μL，Mg2+取2 μL，并加入去酶水至總體積為50μL。以95℃ 3min預變性并進行95℃ 20s退火、56℃30s變性、72℃ 40s延伸，循環32次，72℃ 5min結束（表1）。

表1 禽流感H5型HA基因引物、探針序列

2.2 實時熒光定量逆轉錄PCR優化條件

最終優化的25μL反應體系見表2。最佳PCR條件：95℃ 15s退火、60℃ 20s變性、72℃ 40s延伸，循環38次，并以95℃ 2min、72℃5min進行預擴增及終止。

2.3 標準曲線及特異性檢測

標準曲線相關系數r=0.996，線性相關性良好。特異性檢測見PCR擴增產物與禽流感H5型HA基因同源性100%，其他病原菌包括禽流感H7、H9、DPV、大腸菌等檢測結果陰性。

2.4 檢測時間

從對樣品進行處理至檢測結果，平均時間為（3.8±0.4）h。

3 討 論

實時熒光PCR技術檢測靈敏度、特異度高，且檢測速度快，在傳染病等檢測上具有重要意義[3]。在本研究中，我們可以看到對禽流感H5型進行實時熒光PCR檢測同源性高，檢測時間短，僅（3.8±0.4）h，可用于禽流感H5型病毒菌株的快速篩查。

表3 最終優化的25μL反應體系各組分情況

[1] 高斌,劉敬忠.實時熒光PCR技術的研究及其應用進展[J].診斷學理論與實踐,2005,4(6)：507-509.

[2] 唐秀英,田國斌,趙傳珊,等.中國禽流感流行株的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報,1998,20(1)：1-5.

[3] 馬莉,湯承,岳華,等.TaqMan實時熒光RT-PCR快速檢測H5亞型禽流感病毒[J].黑龍江畜牧獸醫,2009(3)：12-14.