實時熒光PCR技術(shù)快速檢測禽流感病毒H5型探討

王七生

（桂林市疾病預(yù)防控制中心，廣西 桂林 541001）

PCR技術(shù)一直作為一種敏感性高的核酸分子檢測方法于科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。但由于其難以進行定量檢測，同時還存在污染[1]等問題，在臨床應(yīng)用中受到限制。隨著實時熒光PCR技術(shù)的引入與發(fā)展，PCR技術(shù)逐步應(yīng)用于臨床病原體等檢測與診斷。考慮到H5型是國內(nèi)禽流感病毒常見的血清型[2]，筆者現(xiàn)將實時PCR技術(shù)應(yīng)用于禽流感病毒H5型檢測，以期為禽流感病毒研究提供更快速有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒菌株

禽流感病毒H5型均本研究所提供。

1.2 主要試劑及儀器

本研究所用PCR儀器為美國ABI公司生產(chǎn)，型號為7300。所用凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad生產(chǎn)的Gel Doc2000。所用分光光度計為美國Varian生產(chǎn)的Cary50Probe紫外光度計。試劑盒包括提取RNA的試劑盒等均從Amersham Biosciences 購買。所用超速離心機為德國Eppendorf生產(chǎn)。本研究所用試劑TaKaRa實時PCR試劑盒等均從大連寶生物公司購買。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物及探針設(shè)計、合成

根據(jù)GenBank上禽流感H5型HA核酸序列，并結(jié)合DNASTAR軟件做同源分析，以獲得研究所需H5型HA保守核算序列，并經(jīng)引物相關(guān)軟件（如Primer等）、探針相關(guān)軟件如（Oligo等）進行引物、探針設(shè)計，同時將已設(shè)計好的引物、探針交由寶生物公司合成。

1.2.2 目的基因擴增、測序、特異性檢測

先根據(jù)試劑盒方法提前RNA，并以其為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進一步擴增目的基因。制備陽性標準品，并進行測序以確定所獲陽性標準品為禽流感H5型HA基因。之后根據(jù)實時PCR試劑盒提供的優(yōu)化方法進行退火溫度、離子濃度（主要是Mg2+）、探針濃度、引物濃度等優(yōu)化，并建立標準曲線。標準曲線建立方法即：將陽性標準品置于260nm紫外光下進行吸光度測定，以計算出DNA的拷貝數(shù)。并分別連續(xù)10倍稀釋且進行熒光PCR檢測以獲得標準曲線，且經(jīng)重復(fù)性、敏感性檢測。同時H5型HA基因與禽流感H7、H9、其他病毒包括ILTV、DPV、大腸菌O46進行特異性檢測。

2 結(jié) 果

2.1 引物、探針序列及特異性檢測結(jié)果

禽流感H5型HA基因引物、探針序列如表所示，基因片段150bp，與另82種禽流感H5亞型同源性達100%，高度保守。經(jīng)RT-PCR擴增片段并進行測序，與預(yù)期片段基本一致（圖1），可初步證實擴增片段是目的片段。RT-PCR擴增（50μL體系）：dNTPs取2μL，上下游引物分別取1μL，聚合酶取0.5μL，PCR緩沖液取102μL，Mg2+取2 μL，并加入去酶水至總體積為50μL。以95℃ 3min預(yù)變性并進行95℃ 20s退火、56℃30s變性、72℃ 40s延伸，循環(huán)32次，72℃ 5min結(jié)束（表1）。

表1 禽流感H5型HA基因引物、探針序列

2.2 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR優(yōu)化條件

最終優(yōu)化的25μL反應(yīng)體系見表2。最佳PCR條件：95℃ 15s退火、60℃ 20s變性、72℃ 40s延伸，循環(huán)38次，并以95℃ 2min、72℃5min進行預(yù)擴增及終止。

2.3 標準曲線及特異性檢測

標準曲線相關(guān)系數(shù)r=0.996，線性相關(guān)性良好。特異性檢測見PCR擴增產(chǎn)物與禽流感H5型HA基因同源性100%，其他病原菌包括禽流感H7、H9、DPV、大腸菌等檢測結(jié)果陰性。

2.4 檢測時間

從對樣品進行處理至檢測結(jié)果，平均時間為（3.8±0.4）h。

3 討 論

實時熒光PCR技術(shù)檢測靈敏度、特異度高，且檢測速度快，在傳染病等檢測上具有重要意義[3]。在本研究中，我們可以看到對禽流感H5型進行實時熒光PCR檢測同源性高，檢測時間短，僅（3.8±0.4）h，可用于禽流感H5型病毒菌株的快速篩查。

表3 最終優(yōu)化的25μL反應(yīng)體系各組分情況

[1] 高斌,劉敬忠.實時熒光PCR技術(shù)的研究及其應(yīng)用進展[J].診斷學(xué)理論與實踐,2005,4(6)：507-509.

[2] 唐秀英,田國斌,趙傳珊,等.中國禽流感流行株的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,1998,20(1)：1-5.

[3] 馬莉,湯承,岳華,等.TaqMan實時熒光RT-PCR快速檢測H5亞型禽流感病毒[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2009(3)：12-14.