強心飲對心肌病大鼠模型細胞凋亡因子的影響

嚴 驊 高俊杰

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞的持續(xù)丟失是心力衰竭發(fā)展進程中最主要的因素，而心肌細胞凋亡可能就是其持續(xù)丟失的根源所在［1,2］。強心飲是名老中醫(yī)經驗方，標本兼顧，在臨床上應用于心肌病心力衰竭患者治療，療效明顯，但對其作用機制尚未進行過研究。本研究運用阿霉素制備心力衰竭大鼠模型，觀察強心飲對模型大鼠心肌細胞凋亡的作用，探討該藥對防治心肌病心力衰竭的可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇80只體質量180～200g的SPF級Wistar雄性大鼠（上海中國科學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK（滬）2007-0005；飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號SYXK（滬）2009-0069）。

1.2 藥物

強心飲由附子、茯苓、白術、白芍、仙靈脾、補骨脂、炙鱉甲等組成，總劑量173g，均購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥房，按處方比例稱取中藥材，加水煎煮、濃縮，取上清，置4℃?zhèn)溆茫慌噙崞绽ㄊ┚S雅，批號9D0437）；滅菌注射用生理鹽水均為市售品；鹽酸阿霉素粉針（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號091001）。

1.3 試劑與儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒由碧云天生物技術研究所提供；大鼠Bcl-2、BAX ELISA試劑盒均由西唐生物技術研究所提供。DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標儀，芬蘭；GE心動超聲儀Vivid i S/N及探頭10S-RS，美國；奧林巴斯顯微鏡DP71，日本；Leica TcsSP2型激光共聚焦掃描顯微鏡，德國。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

Wistar雄性大鼠80只，除空白對照為10只大鼠外，余組數(shù)量相同。將鹽酸阿霉素粉針用滅菌注射用生理鹽水配成濃度為1mg/mL的阿霉素溶液（避光）。除空白對照組外，其余各組大鼠分別于每周尾iv阿霉素溶液2mg/kg，共6周造模。空白對照組ip等容積生理鹽水。各治療組在注射阿霉素同時，開始ig強心飲低、中、高劑量組（分別為含生藥4.325g/kg、8.65g/kg、17.3g/kg）和培哚普利4mg/（kg·d）；空白對照組和模型組給予同體積蒸餾水ig。

1.4.2 取材

治療結束后，用25%烏拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，應用心動超聲儀分別測量血流動力學。然后心臟采血，摘取左心室，洗凈，以備后續(xù)實驗。

1.4.3 TUNEL法檢測凋亡細胞

切取部分左心室組織制作組織切片，用4%多聚甲醛液固定，常規(guī)制作切片。使用CHEMICON international ApopTag? Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit S7110試劑盒。采用dUTP介導的末端標記技術原位檢測凋亡心肌細胞。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察標記結果：凋亡細胞的形態(tài)特征為核中有熒光染色顆粒。

1.4.4 BCA蛋白濃度測定

組織勻漿制備：冰浴下迅速剪取部分左心室組織，置冰凍組織于離心管，按每200mg加入1mL勻漿介質中（PH7.4，0.01mol/L Tris-HCL，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/Lsugar），冰浴電動勻漿，處理3～4min后，冰浴10min，振蕩，4℃，12000 r/min離心15min，取上清備用。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定組織蛋白濃度。酶標儀562nm處測定。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。

1.4.5 凋亡因子檢測

采用ELISA法檢測大鼠胞漿Bcl-2，BAX含量。檢測方法參照試劑盒說明書。

1.4.6 統(tǒng)計方法

2 結 果

2.1 強心飲對心肌損傷有保護作用

我們的前期研究結果表明，強心飲能夠通過調節(jié)模型大鼠的部分神經內分泌指標的過度增高，從而減輕心肌重構，改善心功能，保護心臟[3,4]。

2.2 強心飲對心肌細胞凋亡影響

心肌凋亡免疫熒光結果顯示：空白對照組細胞凋亡數(shù)很少，基本很難檢測到陽性信號（圖1-A）；阿霉素造模6周后，模型組凋亡明顯增加（圖1-B），與模型組相比：培哚普利組、強心飲組細胞凋亡數(shù)較模型組明顯減少（圖1-C、D）。

2.3 強心飲對心肌Bcl-2、Bax含量的影響

見表1。與空白對照組比較，模型組Bcl-2含量明顯降低，而Bax含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，培哚普利組和強心飲高劑量組的Bcl-2含量明顯提升（P＜0.05）；強心飲各劑量組的Bax含量均明顯下降（P＜0.05、P＜0.01）；各治療組的Bcl-2/Bax比值較模型組顯著提高（P＜0.01）。

圖1 強心飲對心肌細胞凋亡TUNEL表達的影響（x200）

表1 對各組大鼠CytC、Bcl-2、BAX含量的影響（±s）

表1 對各組大鼠CytC、Bcl-2、BAX含量的影響（±s）

注：與模型組比較 1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 劑量(g/kg) n Bcl-2(pg/mg) BAX(Pg/mg) Bcl-2/BAX空白 — 10 29.48±3.18 1） 25.99±7.57 1） 1.21±0.11 2）模型 — 9 22.76±1.62 34.26±7.57 0.70±0.06培哚普利 2× 10 31.11±8.54 1） 29.57±9.64 1.13±0.112）強心飲低 10-3 10 25.68±4.62 24.97±4.982） 1.05±0.072）強心飲中 4.325 10 23.96±3.57 23.72±3.642） 1.03±0.062）強心飲高 8.65 10 29.83±12.15 1） 26.77±7.30 1） 1.08±0.192）17.3

3 討 論

心力衰竭是心臟病的危重階段，多數(shù)患者常因心力衰竭進行性加重而死亡或因心律心常而發(fā)生猝死，因其發(fā)病率及病死率高而成為亟待解決的難題。在中醫(yī)學中，并無心肌病心力衰竭之病名，但有類似癥狀的描述，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，此病可歸于中醫(yī)“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“喘證”“痰飲”“水腫”之范疇。心主血脈，心藏血脈之氣，血脈之運行依賴于心陽、心氣溫煦和推動。心力衰竭多病重日久，致心氣陽虛，心主血脈功能失司，血脈瘀阻。而久病及腎，亦可致命門火衰，不能溫煦心陽，則致君火更衰。可見，本病重在陽氣虧虛，并由此繼發(fā)水飲瘀血等標實之候，且水飲瘀血一經產生，再傷陽氣，而致陽氣更虛，故本病為本虛標實之候，且虛實錯雜，多臟受累，纏綿難愈。強心飲以溫補心腎、利水化痰消瘀為治療原則，標本兼顧，在臨床上收到了良好的療效。

我們選擇采用大鼠尾靜脈注射阿霉素復制心慢性力衰竭模型，造模時間為6周，使心肌和心功能慢性損害更接近臨床[5]。本實驗結果表明，當大鼠尾靜脈間斷注射小劑量阿霉素而出現(xiàn)心肌病心力衰竭時，大鼠的心肌細胞凋亡明顯增多，而空白對照組大鼠的心肌細胞凋亡數(shù)量極少。用強心飲干預的大鼠，心肌細胞凋亡的數(shù)量也較模型組明顯減少。這一結果證實心肌細胞凋亡與心肌病心力衰竭的發(fā)生發(fā)展有密切關系。

在細胞凋亡中，線粒體被認為是起著中央調控作用[6]。現(xiàn)在普遍認為，在對細胞線粒體的調控中，Bcl-2家族的Bcl-2和BAX起著重要的作用。Bcl-2位于線粒體的內外膜交接處的抗凋亡蛋白，抵抗細胞凋亡。相反Bax作為一種促凋亡蛋白，一旦接受細胞凋亡信號時構象發(fā)生變化，導致線粒體內物質的釋放。又有實驗證實，Bcl-2和BAX等具有成孔性質，可直接調節(jié)線粒體膜的通透性[7]，它們的表達比例變化可影響線粒體內的促凋亡物質流入胞漿而引發(fā)細胞凋亡。

從本實驗結果可以看出，與空白對照組相比，模型組Bcl-2含量下降，Bax含量升高，而強心飲治療組及培哚普利組Bcl-2升高、Bax降低，Bcl-2與Bax的比例較模型組有顯著的提高。由此可見，強心飲通過調控Bcl-2和Bax的平衡，起到阻止細胞凋亡的發(fā)生、延緩或改善心肌重構的發(fā)生及發(fā)展的作用。其更詳細的作用機制，還有待于進一步的深入研究。

[1]Yamada T,Matsumori A,Wang WZ,et al.Apoptosis in congestive heart failure induced by viral myocarditis in mice[J].Heart vessels,1999,14(1)：29.

[2]Colucci WS.Molecular and cellular mechanisms of myocardial failure[J].Am J Cardiol,1997,80(11A)：15.

[3]嚴驊,高俊杰,蔣梅先,等.強心飲對阿霉素心肌病心力衰竭大鼠模型心肌重構的影響[J].上海中醫(yī)藥大學學報,2010,24(3)：65.

[4]嚴驊,高俊杰,蔣梅先,等.強心飲對阿霉素誘導大鼠慢性心肌損傷的保護作用[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2010,16(7)：557.

[5]McFalls EO,Paulson DJ,Gilbert EF,et al.Carnitine protection against adriamycin-induced cardiomyopathy in rats[J].Life Sci,1986,38(6)：497.

[6]Newmeyer DD,Ferguson-miller S.Mitochondria：Releasing power for life and unleashing machineries of death[J].Cell,2003,112(4)：481.

[7]Jia L,Srinivasula SM,Liu FT,et al.Apaf-1 protein deficiency confers resistance to cytochrome c-dependent apop tosis in human leukemia cells[J].Blood,2001,98(2)：414.