HPLC測定益氣升降湯中葛根素的含量

楊建明 曹 亮 鄭月霞

（1 河北北方學院基礎醫學院，河北 張家口 075000；2 河北北方學院附屬第一醫院，河北 張家口 075000；3 河北北方學院醫學院藥學專業2004級，河北 張家口 075000）

益氣升降湯主要由葛根、黃芪、五味子等中藥組成，具有擴張冠狀動脈及腦血管作用，冠狀動脈血流明顯增加，降低心肌收縮功能，改善微循環作用。臨床上主要用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛治療，對缺血性腦血管疾病也有較好的療效。葛根為益氣升降湯的主要有效成分之一，其主要化學成分為異黃酮類化合物，葛根素為其代表性化合物，是藥典中葛根藥材和有關制劑的主要檢測指標。益氣升降湯現行質量標準僅有性狀的描述及檢查項，尚無鑒別項及含量測定的內容，根據中藥藥性的配伍原則，主要為葛根，為更好地控制其內在質量，現對處方進行定性鑒別，應用高效液相色譜法測定主藥葛根的有效成分葛根素的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SSI高效液相色譜儀（美國）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BP2IID型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；WFH-203B型三用紫外分析儀（上海精科實業有限公司）；SZ-97A自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；薄層層析硅膠板GF254型（青島海洋化工廠）；葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，含量測定用）；益氣升降湯及陰性對照（自制）；甲醇為色譜純，水為三重蒸餾水（藥理實驗室自制），其他試劑均為分析純。

1.2 處方與制備

1.2.1 處方

陳皮10g、半夏10g、茯苓10g、甘草6g、枳實12g、竹茹12g、黨參30g、麥冬10g、五味子10g、桔梗10g、黃芪30g、葛根30g。

1.2.2 制備方法

按處方量精密稱取各組分，粉碎均勻后進行中藥有效成分提取：水煎煮全藥，待沸騰后再煮30min，傾出第一煎液，靜置后傾出濾液，向原藥中倒入適量水同法繼續煎煮，傾出第二煎液，靜置后傾出濾液。合并兩次濾液按1g/mL進行濃縮。陰性對照按上述方法不加葛根進行提取濃縮即可。

1.3 定性鑒別

1.3.1 對照品、供試品、陰性對照品溶液的制備

取葛根素對照品溶液加甲醇制成1mg/mL，作為對照品溶液（Ⅰ）；取本品5mL置小燒杯中，水浴濃縮成稠膏狀，加甲醇15mL，超聲處理30min，過濾，取濾液作為供試品溶液（Ⅰ）；取缺葛根素的陰性樣品，按供試品溶液制備法制得陰性對照液（Ⅰ）。

1.3.2 薄層鑒別

照薄層色譜法試驗吸取上述溶液各4μL分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-水（42∶15∶1.5）為展開劑，展開，展距14cm，取出，晾干，置紫外燈365nm下檢視。

1.4 含量測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（25∶75）；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

1.4.2 對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液的制備

精密稱取葛根素對照品5mg，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得200μg/mL葛根素對照品溶液（Ⅱ）。精密量取供試品溶液（Ⅰ）0.5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇置刻度，搖勻即得供試品溶液（Ⅱ）。陰性對照品溶液（Ⅱ）的制備方法操作同上。

1.4.3 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液（Ⅱ）各1、2、2.5、3.5、5mL，置5個5mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻。吸取上述5份對照品溶液適量，按色譜條件分別依次進樣20μL，測定。

1.4.4 精密度考察

取對照品溶液（140μg/mL），重復進樣5次，每次20μL，測定峰面積。

1.4.5 重復性試驗

精密稱取同一批樣品3份，按本文方法提取制備供試品溶液分別注入液相色譜儀依法測定。

1.4.6 穩定性考察

取供試品溶液（Ⅱ）分別在0、2、4、8、12、24h后進樣，每次20μL，依次測定峰面積。

1.4.7 回收率試驗

精密量取同一批號益氣升降湯3份，每份0.5mL，分別加入葛根素對照品溶液適量，按本文方法制備供試品溶液，進樣20μL，按上述色譜條件測定峰面積，計算回收率。

1.4.8 樣品含量的測定

取益氣升降湯3批，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件進行分析，根據外標法進行計算葛根素的含量。

2 結 果

2.1 定性鑒別

供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的天藍色斑點，陰性對照液無此斑點，說明供試品中含有葛根素，見圖1。

圖1 益氣升降湯的薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜系統性考察

所有組分均在55min內洗脫出柱，基線平穩。

2.2.2 線性關系考察

以峰面積為縱坐標，葛根素的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=38515X+27722，r=0.9992。結果表明，葛根素質量濃度在40～200μg/mL與峰面積有良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗

葛根素的峰面積RSD=0.77%，表明精密度良好。

2.2.4 重復性試驗

益氣升降湯中葛根素含量平均值為3.35mg/mL，RSD為3.6%。

2.2.5 穩定性試驗

葛根素峰面積的RSD為0.84%，結果表明供試品溶液在24h內基本穩定。

2.2.6 回收率試驗

葛根素的平均回收率為98.93%，RSD為2.7%。

2.2.7 樣品含量的測定

3批益氣升降湯中葛根素的平均含量為3.36 mg/mL。

3 討論與結論

3.1 提取方法的選擇

葛根及葛根制劑中葛根素的提取方法有回流提取法和超聲提取法[2-4]，同時文獻報道葛根素提取方法都為超聲提取，從操作的簡便性和提取的完全性考慮，我們采用了超聲提取方法。

3.2 檢測波長的選擇

參考有關文獻[5-9]，本實驗選用了250nm，254nm檢測波長，發現在254nm波長處檢測靈敏度高，分離度好，所以選用254nm為檢測波長。

3.3 實驗過程中的其他發現

薄層時在展缸內貼一塊和內壁大小差不多的濾紙，可以解決因展開劑過于飽和而導致展開時間過長的問題。方法學研究結果表明，采用薄層色譜法對處方中的葛根進行定性鑒別，用高效液相色譜法對處方葛根中葛根素進行含量測定，操作簡單，結果準確，重復性好，能夠有效的控制產品質量。

3.4 結論

本方法能達到有效分離各組分的目的，且空白實驗證明在葛根素色譜峰處其他成分無干擾，具有分離效果好、靈敏、準確、簡便快速等優點，可作為益氣升降湯的含量測定質量控制標準。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社,2005：233-234.

[2] 康延國.中成藥薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛生出版社,1995：330-331.

[3] 杜迎翔,苗云明,鄒志紅.葛根湯的薄層色譜鑒別法研究[J].化工時刊,1998,12(5)：27-30.

[4] 李發美.醫藥高效液相色譜技術[M].北京：人民衛生出版社,1999：539-540.

[5] 張新春,蔡大偉,劉晉華,等.心腦通口服液的質量標準[J].中國藥師,2005,8(3)：225-227.

[6] 劉正坤,譚生建,劉剛,等.高效液相色譜法測定感冒解熱沖劑中葛根素的含量[J].中國中藥雜志,1997,22(11)：735-736.

[7] 濮存海,張曉騫.HPLC測定小兒感冒舒顆粒中葛根素的含量[J].中成藥,2001,26(8)：附6-附7.

[8] 錢頻非.清熱降糖顆粒中葛根素的含量測定[J].時珍國醫國藥,2006,17(11)：2258-2259.

[9] 黃亞非,張永明,何翱,等.采用高效液相色譜法測定心脈通口服液中葛根素的含量[J].中國中藥雜志,2001,26(11)：760-761.