FITC標記胰島素的合成、純化及表征

李 錚 褚麗蕓 鄭愛萍*

（1 北京市藥品審評中心，北京 100053；2 邯邢冶金礦山局總醫院，河北 邯鄲056005；3 軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

胰島素（insulin，INS）是一種由51個氨基酸組成的蛋白多肽類藥物，是目前臨床治療糖尿病最主要、最有效的藥物。但由于胃酸的破壞、消化酶的降解以及難以跨越生物膜的機械屏障作用等使得該類藥物口服無效，只能以注射的形式給藥，且往往需要長期反復地頻繁給藥，為患者帶來極大的不便，因此近十幾年來開發口服給藥系統的胰島素納米粒制劑已引起國內外藥學工作者的廣泛關注[1-3]。INS相對分子質量大（相對分子質量約5800），并且由于強親水性而使其難以跨越脂質膜吸收，為了改善和提高水溶性藥物的口服吸收利用度，口服吸收機制的研究非常重要，其中以Caco-2細胞為模型，結合激光共聚焦技術和流式細胞技術，開展藥物口服吸收機制的研究是一種常用的途徑[4-8]。本研究以異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）作為熒光探針設計合成了熒光標記的INS（FITC-INS），此標志物可用于激光共聚焦顯微鏡的觀察或流式細胞儀的檢測，以探討INS跨膜轉運的吸收機制。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

胰島素原料（27.8IU/mg，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司），血糖測定試劑盒（包括標準葡萄糖溶液，酶試劑RI，緩沖液RⅡ，北京中生生物工程高技術公司），SP-葡聚糖凝膠C-25（Pharmacia公司）、異硫氰酸熒光素（Sigma公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

質譜儀（MDS SCIEX QSTAR 美國ABI），熒光分光光度計（RF-5301日本島津），冷凍干燥機（ALPH2-4，Christ德國），85-2恒溫磁力加熱攪拌器（上海國華企業），WH-2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠），倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電儀器總公司）；高速臺式離心機（TGL-16C，上海安亭科學儀器廠）；BP211D電子天平（Sartorius）。

SD大鼠，體質量（250±20）g，雌雄兼有，軍事醫學科學院實驗動物中心，動物質量合格證明編號：SCXK（軍）2007-004。

2 實驗方法

2.1 FITC-INS的標記及純化[9]

2.1.1 FITC-INS的標記

稱取胰島素及FITC適量，使二者的摩爾比約為1∶3。胰島素溶于pH 7.2的磷酸緩沖液（含0.2mmol/L EDTA，防止胰島素聚集），濃度為20mg/mL；FITC溶解于1/10溶液體積的丙酮。將FITC溶液加入胰島素溶液中，避光下置磁力攪拌器攪拌12h，所得產物為標記混合物，由標記產物FITC-insulin、未反應完全的胰島素及剩余的游離FITC組成。

2.1.2 FITC-INS的純化

采用葡聚糖凝膠對上述標記混合物進行分離。將溶脹好的Sephadex G-25裝入玻璃柱，柱直徑1.5cm，長20cm。柱床預先用pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液飽和，然后將反應液上樣，每次1.0mL。用pH 7.2的0.01mol/L磷酸緩沖液洗脫，可見二條黃色條帶，收集第一條黃色帶的洗脫液。將洗脫液以醋酸調到pH 4.5，于4℃冷藏過夜，則FITC-INS形成沉淀，3500rpm離心15min，棄上清，沉淀以pH 4.5醋酸溶液洗滌，凍干，即得純化的FITC-INS。

2.2 FITC-INS質譜鑒定

分別對樣品游離INS和FITC-INS進行質譜分析，通過對比以鑒別INS是否連接上FITC分子。

2.3 FITC-INS活性鑒定

2.3.1 糖尿病大鼠模型的建立

取雄性健康SD大鼠實驗前禁食24h，按40mg/kg劑量給大鼠尾靜脈注射1%四氧嘧啶溶液，正常飼養48h，從眼靜脈叢取血約0.5mL，3000rpm，離心15min。取血清20μL，葡糖氧化酶法測定血糖，選用血糖范圍為13.89～16.67mmol/L大鼠為高血糖模型大鼠。

2.3.2 血糖值的測定

2.3.2.1 測定原理

葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，后者在過氧化物酶的作用下放出氧，使4-氨基安替吡啉與酚氧化縮合，生成紅色醌亞胺染料，可在505nm比色測定。

2.3.2.2 樣品的采集

正常大鼠15只，分為3組，實驗前禁食12h，以乙醚麻醉后，皮下注射給予游離INS溶液（2IU/kg，陽性對照組）及FITC-INS溶液（2IU/kg），并設置生理鹽水空白對照組。各組動物實驗前24h禁食不禁水，自由活動，給藥后于0、1、2、4、6、8、12、16、24h眼眶取血，離心得血清，測定血糖值。

2.3.2.3 樣品處理及測定

將收集的血樣于3000rpm離心10min，準確取血漿10μL，測定血糖值。按表1中所示加樣混勻后，37℃水浴保溫15min，505nm波長下測定各管的吸光度值（A），計算血糖含量（mg/dL）。

表1 測定血糖樣品的制備

血糖含量（mg/dL）＝A樣品/A標準×C標準

血糖下降百分率（%）＝（給藥前血糖值－給藥后血糖值）/給藥前血糖值×100%。

2.3.2.4 數據處理

實驗數據以mean±SD表示，各組間比較采用t檢驗。

3 結果與討論

3.1 FITC-INS標記及純化

FITC具有異硫氰基（-N=C=S），在適當的條件下，它與INS所含氨基酸的自由氨基（主要是賴氨酸的ε-氨基）結合，形成熒光色素－蛋白質結合物。由于FITC的異硫氰基以共價結合的方式連接到INS分子的氨基上，所以結合比較牢固而穩定。二者的投料比為3∶1，所得反應物為混合產物，由標記產物FITC-INS、游離INS及過剩FITC組成。

標記混合物在凝膠濾過色譜柱上呈現兩條色帶，即FITC-INS和過剩FITC，而游離INS不顯色，由于凝膠濾過色譜柱的分子篩原理，洗脫的第一條色帶為熒光標志物FITC-INS，洗脫的第二條色帶為游離INS。收集第一條色帶的洗脫物進行質譜鑒定。

3.2 FITC-INS質譜測定結果

FITC-INS質譜測定結果見圖1，游離INS的質譜圖見圖2。從質譜圖1和2分析，該物是一個混合物，由兩個組分構成：其中一個相對分子質量為5778.1，另一個相對分子質量為6167.7。相對分子質量為5778.1的質譜峰代表INS分子，這與文獻所報道的豬結晶胰島素的數值5777.6幾乎相等。與6167.7的差值為389.6，恰好是一個FITC分子的分子量（389），說明在INS分子上連接有1個FITC分子。

圖1 FITC-INS質譜圖

圖2 INS質譜圖

圖3 糖尿病大鼠皮下注射熒光標志物FITC-INS的血糖降低值，以INS皮下注射為陽性對照組，生理鹽水為空白對照組(mean±SD，n=5)

因為胰島素分子中有3個游離氨基可以被FITC標記，所以在某些條件下會出現多種標記產物。為了盡量減少標志物對藥物性質的影響，最好能獲得只有一個氨基被標記的單一標志物，而且盡量保持胰島素的活性。本研究在相關文獻的調研基礎上，經過反應條件的篩選，最終合成了單一FITC標記的熒光標志物。

3.3 FITC-INS活性鑒定

糖尿病模型大鼠皮下注射胰島素熒光標志物后的血糖降低值如圖3所示。

由圖3可見皮下注射組（游離INS組和熒光標記FITC-INS組）與生理鹽水空白組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。此外，與游離INS皮下注射組相比，熒光標記FITC-INS組的降低血糖作用無顯著性差異（P＞0.05），表明了標志物FITC-INS保留了原藥INS的生物活性。

皮下注射游離INS組和皮下注射FITC-INS組二者的達峰時間一致，皮下注射2h時，大鼠血糖降至最低值，游離INS組和FITC-INS組分別達到36.21%±5.31%、41.67±6.77%，二者之間無限制性差異。由圖3可見，皮下注射6h后大鼠血糖逐漸恢復正常值。

[1] Sonaje K,Lin YH,Juang JH,et al.In vivo evaluation of safety and efficacy of self-assembled nanoparticles for oral insulin delivery[J].Biomaterials,2009,30(12)： 2329-2339.

[2] Avadi MR,Sadeghi AMM,Mohammadpour N,et al.Preparation and characterization of insulin nanoparticles using chitosan and Arabic gum with ionic gelation method[J].Nanomedicine,2010,6(1)：58-63.

[3] Sonaje K,Chen YJ,Chen HL,et al.Enteric-coated capsules filled with freeze-dried chitosan/poly(γ-glutamic acid) nanoparticles for oral insulin delivery[J].Biomaterials,2010,31(12)： 3384-3394.

[4] Stephan AM,Ulrich FS,Stefan B,et al.Pharmacokinetics of amino acid ester prodrugs of acyclovir after oral administration： Interaction with the transporters on Caco-2 cells[J].Int J Pharm,2008,362(1/2)：93-101.

[5] Suresh K,Ritesh J,Deep K,et al.Quantitative prediction of oral absorption of PEPT1 substrates based on in vitro uptake into Caco-2 cells[J].Int J Pharm,2008,354(1/2)：104-110.

[6] Rikako S,Tomomi S,Yasuyuki T,et al.Novel oral absorption system containing polyamines and bile salts enhances drug transport via both transcellular and paracellular pathways across Caco-2 cell monolayers [J].Int J Pharm,2009,367(1/2)：103-108.

[7] Fuyuki M,Koji T,Masateru M,et al.Development of a highthroughput in vitro assay using a novel Caco-2/rat hepatocyte system for the prediction of oral plasma area under the concentration versus time curve (AUC) in rats[J].J Pharm Toxic Meth,2006,53(3)：215-218.

[8] Cheng KC,Li C,Hsieh YS,et al.Effect of oral contraceptives on the transport of chlorpromazine across the CACO-2 intestinal epithelial cell line[J].Eur J Pharm Biopharm,2003,56(2)：159-165.

[9] Bromer WW,Sheehan SK,Rerns AW,et al.Preparation and properties of fluoresceinthiocarbamyl insulin[J].Biochemistry,1967,6(8)：2378-2388.