黃酮類化合物對鈣調素的拮抗作用

崔碧玲

（佛山市婦幼保健院，廣東 佛山 528000）

在研究鈣調素拮抗劑的系統(tǒng)中，以CaM-PDE-（Ⅰ）系統(tǒng)研究得最為清楚。該系統(tǒng)的原理如下：

本實驗將牛腦勻漿經過熱處理后通過纖維素離子交換（DEAE-23）柱層析與葡聚糖凝膠分子篩（SephedrxG50）柱層析分離出鈣調素純品；將牛心勻漿經硫酸銨沉淀后，進行纖維維素離子交換（DEAE-23）柱層析提取出磷酸二酯酶-（Ⅰ）。由于PDE-Ⅰ既是CaM的靶酶，能水解cAMP最終產生一分子的無機磷，所以鈣調素拮抗劑能降低PDE-Ⅰ對cAMP的水解作用，減少產生的無機磷。通過對反應系統(tǒng)最終生成的無機磷量進行測定，可以檢測出CaM依賴的PDE-Ⅰ的活性，再推算出CaM的活性。

1 試劑與儀器

試劑：DEAE-23：Whatman；Sephedex G 50：Pharmacia；TFP，cAMP：Sigma；PMSF。

儀器：高速冷凍離心機（GL20A：湘儀）；紫外-可見分光光度計（U2000：日本日立）。

2 實驗操作和結果

2.1 牛腦CaM提取純化[1]

[1]，略加改動，-50℃保存牛腦凍，1∶3（W/V）加入預冷Buffer A（含25mM Tris-HCL，pH7.5，5mM EDTA-2Na；0.2mM PMSF）制勻漿。10000rpm離心30min。取上清液，沸水浴5min，立即放入鹽冰浴冷卻。10000rpm離心40min，收集上清液。用Buffer B（25mM Tris-HCL，PH7.5；1mM EGTA）平衡洗滌DEAE-23柱兩個體積。加入上清液，用含0.15Mnacl及0.5Mnacl Buffer B各250mL線性梯度洗脫。每管按5mL/10min收集，合并含CaM管，超濾濃縮。濃縮液上Sepledex G-50柱，用含0.2Mnacl的Buffer B洗脫，每管按2.5mL/6min收集，A280測蛋白。合并CaM管，-20℃包埋保存。

2.2 牛心PDE-Ⅰ制備[2]

參考文獻[2]，略加改動，操作在4℃以下進行。牛心按1∶3（W/V）加入預冷Buffer A（20mM Tris-HCL；pH7.5；1mM EDTA-2Na；1mM EGTA）制勻漿。10000rpm離心30min。取上清液，加入硫酸銨至60%飽和度，緩慢地攪拌，并加入氨水保持pH為8.0，沉淀用少量Buffer B（20mM Tris-HCL；PH7.0；1mM MGAC2；1mM EGTA咪唑；1mM EGTA；10mM β-MSH）溶解，并用Buffer B透析過液。透析后加至已用Buffer B平衡過DEAE-23柱。先用含0.05M Nacl的Buffer B洗脫至無蛋白（A280測定），再用含0.05M Nacl及0.5M Nacl的Buffer B各250mL線性梯度洗脫。每管按5mL/10mL收集。A280測蛋白，通過定磷法A610測酶活性，收集PDE-Ⅰ峰，-20℃保存。

2.3 PDE-Ⅰ，CaM活性測定方法

用兩步孵浴定磷法：按表1加入試劑

表1 試劑加入量（單位mL）

30℃水浴30min后，沸水浴終止反應，冷卻。加1mg/mL蛇毒0.1mL，30℃再水浴10min，加入55%三氯乙酸（TCA）0.1mL，離心15000rpm 3min。取上清液0.1mL，加入0.1M NaOH 0.2mL，25mM Tris-HCL，（pH7.5）2.5mL，試劑A（1.75%（W/V）鉬酸銨-6.3%（NH4）2SO4）0.5mL，混勻后室溫反應10min。試劑B（含0.35%（W/V）PVA-0.035%（W/V）孔雀綠）0.5mL后，室溫反應10min后，A610測定吸光度，根據(jù)無機磷標準曲線，計算無機磷。再按：pH7.5，30℃下每分鐘水解1nmol cAMP，獲得Pi為下一個PDE-Ⅰ活性單位，推算酶活性。

一個CaM單位定義為上述體系中激活PDE-Ⅰ最大活性的50%時的量。

3 結 果

三種黃酮類化合物皆對CaM-PDE激活系統(tǒng)有拮抗作用，表明它們可通過抑制鈣調素而影響PDE。其ⅠC50值分別為楊梅素：19μmol/L，槲皮素：27μmol/L，蛇葡萄素：88μmol/L。以楊梅素的作用最強。從以上實驗表明三種黃酮類化合物皆為特異的鈣調素拮抗劑。

4 討 論

4.1 在分離提取鈣調素時，利用鈣調素耐熱的性質，通過沸水浴將大量雜質蛋白變性除去。提取分離所用的緩沖系統(tǒng)中，都含有0.1mmol/L的氟化甲基磺酰基苯，作為蛋白水解酶抑制劑。

4.2 在檢測cAMP水解終產物無機磷時，本實驗使用了Vanveldhoven的定磷方法，此方法的靈敏度達μmol/L水平，因而要求實驗過程嚴格防止無機磷的污染，

4.3 由于PDE-（Ⅰ）本身即對cAMP有輕微激活，應用cAMP-PDE-（Ⅰ）對cAMP的基礎激活，限制在一定范圍。

參考文獻

[1]葉正華,孫大業(yè),郭季芳.鈣調素親和層析柱的制備及其應用[J].生物化學與生物物理進展,1988,15(5):56.

[2]丁文勇,任鳳,趙寶昌.鈣調素依賴性的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的制備[J].吉林大學自然科學學報,1999,7(3):81-84.