原子力顯微鏡掃描成像DNA分子

冉詩勇，王艷偉，楊光參

（溫州大學 物理與電子信息工程學院，浙江 溫州325035）

1 引 言

1982年，IBM瑞士蘇黎士實驗室的賓尼（Gerd Binning）和羅雷爾（Heinrich Rohrer）研制出世界上第一臺掃描隧道顯微鏡（STM）［1］，STM使人類能在原子或分子的尺度上觀察甚至操縱原子，他們也因此獲得了1986年的諾貝爾物理學獎．STM要求掃描樣品是導電材料，應用上受到了限制．為了拓寬應用范圍，1986年賓尼在STM的基礎上發明了原子力顯微鏡（AFM）［2］．AFM對樣品無特別要求，一經發明就在各領域研究特別是在生物大分子（如DNA、蛋白質）掃描成像研究領域得到了廣泛的應用．

傳統的近代物理實驗教學一般引入STM掃描實驗［3－5］，所用樣品一般是成品，學生親自動手制備樣品可行性較小．與之相比，AFM樣品制備的簡便性使樣品制備這一流程引入實驗教學環節成為可能．已往的科學研究中已積累了不少的生物大分子 AFM 成像技術［6－11］．我們在近年來的近代物理實驗教學中，將生物物理研究實驗技術如單分子實驗技術［12］、AFM等融入近代物理實驗教學和本科生畢業設計，取得了一定的教學效果．本文將先介紹AFM的基本原理，然后介紹AFM用于DNA分子掃描成像的實驗，著重于樣品制備技術和實驗步驟．該實驗既能讓學生掌握AFM的原理，又能讓他們學習一些基本的AFM掃描用生物樣品制備方法．

2 實驗原理

2．1 裝置原理

AFM利用微懸臂上的探針尖端充當力傳感器．圖1（a）為常用探針的光學顯微鏡成像，（b）為側面圖．針尖與樣品之間的作用力會使懸臂偏轉．因此當激光照射在微懸臂的末端時，其反射光的位置也會因為懸臂偏轉而改變，造成偏移量的產生．系統利用四象限探測器將偏移量記錄下并轉換成電信號．以供控制器作信號處理（圖2）．AFM檢測到懸臂的偏轉后，可以工作在恒高或恒力模式下得到形貌圖像數據．在恒高模式下，掃描器的高度是固定的，根據懸臂的形變信號轉換成形貌圖像，該模式一般用于原子級別平整度樣品成像．在恒力模式下，懸臂偏轉信號輸入到反饋電路，反饋系統根據信號相應地改變由壓電陶瓷管制備的掃描器的Z軸驅動電壓，使之上下運動，以維持針尖和樣品原子的相互作用力恒定．在此過程中，Z軸驅動電壓信號被轉換成形貌圖像數據，該模式一般優先使用．

圖1 不同模式探針的光學顯微鏡成像以及探針的側面圖

圖2 原子力顯微鏡基本結構示意圖

2．2 操作模式

原子力顯微鏡與樣品間的相互作用以范德華力為主，其作用勢能一般用Lennard－Jones勢能函數表示：，式中r是兩原子的核間距，σ是勢能為0時原子核間距，ε是勢阱深度，是勢能曲線上最低點勢能的絕對值．當懸臂尖端的原子與樣品靠近，開始時吸引力起主導作用，隨著距離的減小，二者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡，當兩原子進一步靠近時，范德華力以斥力為主（圖3）．根據使用的力的性質，可以使儀器具有不同的操作模式．接觸模式利用的是針尖與樣品之間的排斥性質范德華力，用于研究柔軟的生物樣品時由于接觸可能使之受到破壞并污染探針產生假象，因此并不是用于生物樣品掃描的理想模式．非接觸模式利用的是針尖與樣品之間的吸引性質范德華力，由于針尖與樣品的間距較大，樣品的掃描分辨率較低．輕敲模式是介于接觸模式和非接觸模式之間的一種掃描模式．該模式下針尖與樣品之間周期性地間歇接觸，好比針尖不斷地敲擊樣品．與非接觸模式的工作原理類似，是使懸臂振動，其振幅比非接觸模式更大，因而能間歇地與樣品接觸．與非接觸模式相比，其分辨率更高；與接觸模式相比，其克服了因針尖劃過樣品而受到的摩擦力、黏附力、靜電力等的影響，并有效地避免了樣品損壞，對于研究比較軟的樣品如生物大分子而言十分有利．

圖3 Lennard－Jones勢能函數示意圖

3 儀器裝置

所用原子力顯微鏡型號為SPM－9600（島津公司），輕敲模式探針購買自Nanoworld，懸臂彈性系數42 N／m，共振頻率320 k Hz．樣品在室溫下以輕敲模式在空氣中成像．所有圖像采集的掃描頻率為2～3 Hz，尺寸為512像素×512像素．所有圖片都經過平滑去噪處理以提高對比度．

4 樣品制備

云母本身是層狀結構，表面具有原子級別的平整度，用透明膠布可以方便地解理得到干凈平整的表面．因此，本實驗將云母切割成合適大小，用雙面膠粘在直徑約1 cm，厚約1 mm的圓形鐵片上，利用其作為襯底制備樣品．實驗所用水均為去離子水．λ－DNA （48，502個堿基對）購于NEB公司，3－氨丙基三乙氧基硅烷（3－aminopropylrtiethoxysilane，APTES）、戊二醛和組蛋白均購于Sigma公司．在實驗時，采用TE（10 mmol／L Tris－HCl＋1 mmol／L EDTA，p H8．0）緩沖液來稀釋λ－DNA．圖4所示是基本的樣品處理流程圖，在該流程基礎上可以增加或稍作改變一些操作步驟以適應樣品制備需求．由于云母表面帶負電，而DNA分子也帶負電，單純地將DNA樣品沉積到云母表面會由于靜電斥力而不能穩定地沉積在云母表面．因而，一般對云母表面進行了修飾或在DNA溶液中加入帶正電的離子．沉積在云母表面的DNA構象一般是溶液中的線團狀態在二維表面上的投影，仍然是二維蜷曲的．為方便觀察或者統計分析，可以在必要時將DNA拉直成像．下面具體介紹這些樣品制備方法．

圖4 樣品制備基本流程示意圖

1）Mg2＋處理DNA方法．首先將TE溶液加入MgCl2使其最終濃度為3．5 mmol／L，然后用該TE＋3．5 mmol／L MgCl2緩沖溶液稀釋原始DNA溶液至1 ng／μL．然后解理云母片得到新的1層云母面，用移液器取約10μL稀釋DNA溶液滴在表面，沉積3 min，然后用約200μL純水沖洗，氮氣吹干放入干燥器1 h以上待掃描．

2）APTES處理云母表面方法．首先取1%（V／V）的APTES水溶液約30μL滴在新解理的云母表面，放置約15 min，用超純水沖洗約5 min，氮氣吹干，然后放置在120℃烘箱中加熱30 min（該步驟的目的是鈍化表面），冷卻后放于干燥器中待用．然后如圖4所示將1 ng／μL的DNA溶液10μL滴在云母表面，沉積3 min，接著用純水沖洗并氮氣吹干放入干燥器．

3）戊二醛修飾云母表面方法．首先將50μL 0．01% （V／V）戊二醛用移液器滴在APTES處理過的云母上，靜置5 min，然后用純水沖洗5 min，氮氣吹干．接下來在該修飾云母上沉積DNA的步驟與圖4所示基本流程相同．

4）DNA拉直方法．首先將約10μL稀釋DNA溶液或DNA－組蛋白復合物溶液滴在APTES處理過的云母片上（由于APTES的疏水作用，小液滴呈現小珠狀），樣品沉積在云母表面約5 min，用鑷子夾著云母片與桌面成45°，氮氣從液滴上方與云母成較小角度吹液滴，使其慢慢脫離云母表面．然后用移液器滴約20μL純水在云母上，用移液器槍嘴稍微接觸液滴的邊緣，按照第一步中液滴移動的方向慢慢吸走樣品，如此重復20次左右，氮氣吹干，干燥．

5 實驗結果與分析

圖5（a）為利用Mg2＋處理方法掃描得到的λ－DNA形貌，可以看到DNA處于自然蜷曲線團狀態，分布均勻，圖像清晰，效果較好．APTES是一種硅烷化試劑，修飾在云母表面后其末端氨基能夠固定DNA片段，因此與Mg2＋處理方法相比具有不易受操作因素而影響沉積DNA構象的優點．圖5（b）是在APTES處理的云母基底上利用拉直技術成像的DNA－組蛋白復合物形貌，可以看到DNA的拉直效果很好，并且DNA與組蛋白結合之后成串珠狀形貌，與染色質結構類似．由于組蛋白帶正電，如果組蛋白濃度過高，其正電荷會完全中和所結合的DNA所帶負電荷，甚至復合物本身帶上正電，從而與APTES處理的帶正電云母基底相排斥，造成復合物不能穩定地沉積，導致掃描成像不能觀察到復合物．因此，利用戊二醛處理云母表面方法沉積帶正電的生物大分子復合物．圖5（c）即為利用該方法得到的高組蛋白濃度下的DNA－組蛋白復合物（組蛋白濃度為60 nmol／L，DNA濃度為1．5 ng／μL）形貌，可以看到復合物仍然能結合在云母上良好成像．該方法的原理是利用戊二醛的蛋白質偶聯作用結合上組蛋白分子并將之固定在襯底上，即使經過沖洗和氮氣干燥步驟也能得到穩定的沉積物．

掃描成像的效果還受操作因素的影響．具體來說，Mg2＋處理方法中如果Mg2＋濃度過高或者沖洗不充分，過多的Mg2＋會通過離子橋連作用造成DNA分子之間的交聯，掃描時得到不理想的網狀結構．圖5（d）是 Mg2＋濃度為5 mmol／L時由于沖洗不充分，有過多的Mg2＋參與DNA分子之間的交聯而造成的網狀結構．而如果沖洗步驟中移液器吸取溶液速度過快造成負壓過高，可能會將已沉積上的大分子吸入或者改變其沉積形貌，很難觀察到沉積的大分子或者非正常的形貌．此外，氮氣干燥時如果氮氣流速過高，可能造成同樣的后果．因此，為提高實驗的可重復性，需要控制吸取速度和氮氣流速使之適中．一般在云母片邊緣以低于3μL／s的速度吸取溶液，干燥時氮氣流速控制在剛好能吹走表面液滴的速度．

圖5 λ－DNA及DNA－組蛋白復合物圖像

6 結束語

本文介紹了利用AFM成像DNA大分子以及DNA－組蛋白質復合物的實驗方法．該方法不僅可用于科學研究，還可引入近代物理實驗教學．該實驗的開設可提高學生的動手操作能力，并對生物學中重要的大分子如DNA分子進行直接觀察，拓寬學生們對生物學與物理學結合領域的認識．

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