喉鱗癌caveolin-1和MVD表達及與頸淋巴結轉移的關系

黃清麗，皇甫輝，史 敏，靳陽子

山西醫科大學第一臨床附屬醫院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

喉鱗癌caveolin-1和MVD表達及與頸淋巴結轉移的關系

黃清麗，皇甫輝，史 敏，靳陽子

山西醫科大學第一臨床附屬醫院耳鼻咽喉科，山西太原 030000

目的：探討喉鱗狀細胞癌組織中caveolin-1 mRNA及蛋白的表達和微血管密度（MVD）與頸淋巴結轉移的關系。方法：采用免疫組化法檢測40例喉鱗狀細胞癌組織中caveolin-1、CD34表達，并用半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（semi-RT-PCR）技術檢測以上組織中caveolin-1mRNA表達水平。結果：不伴頸淋巴結轉移的喉癌組（第1組）的caveolin-1 mRNA相對A值為0.450±0.050，伴有頸淋巴結轉移的喉癌組（第2組）的caveolin-1 mRNA相對A值為0.701±0.073；caveolin-1蛋白第1組中陽性表達率為25.0%，第2組為65.0%，不論從基因還是蛋白水平，兩組相比差異均有統計學意義（均P＜0.05）。CD34免疫組織化學染色結果顯示第2組的MVD值為30.19±2.60顯著高于第1組值 21.34±4.62（P＜0.05）。 喉鱗狀細胞癌組織中 caveolin-1 高表達與 MVD 升高呈正相關（r=0.875，P＜0.05），且二者與頸淋巴結轉移相關。結論：caveolin-1在喉鱗狀細胞癌中的表達可能在腫瘤轉移過程中起了重要作用，與腫瘤血管形成關系密切。

Caveolin-1；喉鱗狀細胞癌；微血管密度；淋巴轉移

頸淋巴結轉移是影響喉鱗狀細胞癌患者預后的關鍵因素。近年研究發現腫瘤內血管生成促進腫瘤浸潤和轉移，在腫瘤血管生成中，caveolin-1發揮重要的作用，但caveolin-1在喉鱗狀細胞癌轉移中的研究較少。本實驗將從基因和蛋白水平探討caveolin-1在喉癌血管生成和腫瘤轉移中的作用，為腫瘤的預防和治療提供新的臨床策略。

1 材料與方法

1.1 材料

選取我科2008年8月～2010年9月期間手術切除的標本，20例不伴有頸淋巴結轉移的喉鱗狀細胞癌組織（第1組），20例伴有頸淋巴結轉移的喉鱗狀細胞癌組織（第2組）。所有喉鱗癌患者均為初發，術前均未接受任何放射或化學治療，每個喉標本在術后立即取材，所取標本切除均經患者及患者家屬同意。caveolin-1多抗購自美國Santa Cruz公司，CD34抗體和小鼠二步法檢測試劑盒購自中杉金橋公司，SP試劑盒購自博奧森公司，Trizol、逆轉錄試劑盒 （TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix）和PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學方法 caveolin-1免疫組織化學用SP方法，CD34免疫組織化學用小鼠二步法：常規石蠟包埋，3μm厚切片后，嚴格按照試劑盒操作說明進行，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性組織切片作陽性對照。1.2.2 RT-PCR法 ①RNA的提取：從每一個Eppendorf管中分別取0.1 g冷凍組織，在液氮中迅速磨碎，采用Trizol試劑提取總RNA。②RT-PCR：應用逆轉錄試劑盒，引物序列：caveolin-1 為 5′-ACA TCT CTA CAC CGT TCC CAT-3′，5′-TGT GTG TCC CTT CTG GTT CTG-3′，GAPDH 為 5′-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3′，5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG GA-3′，按說明書操作逆轉錄合成cDNA第一鏈，并配成50μl反應體系中，于PCR擴增儀循環32個周期，擴增條件：94℃變性 20 s，58℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，GAPDH 為內對照同時擴增。取PCR產物10μl，于2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果并拍照記錄。caveolin-1和GAPDH的擴增片段分別為206 bp和307 bp。

1.3 結果判定

1.3.1 免疫組化法 采用Olympus光學顯微鏡觀察caveolin-1的表達情況，細胞胞質或胞膜呈棕黃、棕褐色為陽性細胞。按染色強度及陽性細胞數計算評分：a染色強度（0=無色，1=淡黃色，2=棕黃色，3=棕褐色），b陽性細胞數 （0=陽性細胞數0～5%，1=陽性細胞數 6%～25%，2=陽性細胞數 25%～50%，3=陽性細胞數＞50%）。a+b之和即為最后得分，得3～6分者為免疫組化陽性。

MVD計數：在不知臨床及病理特征的情況下，在低倍鏡下篩選出最高微血管密度區，在放大200倍的視野下記錄5個視野的微血管數，取其平均數[1]，管腔徑＞8個紅細胞直徑或有肌層的血管不計數。

1.3.2 RT-PCR法 電泳后用自動凝膠圖像分析系統半定量測定caveolin-1各區帶的吸光度值（A值），每例標本相對A值為caveolin-1 A值/GAPDH A值。

1.4 統計學分析

統計學處理應用SPSS 15.0統計分析軟件，采用χ2檢驗、t檢驗，Spearman相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Caveolin-1陽性表達主要在腫瘤細胞胞膜和胞漿的棕黃色顆粒中，血管內皮細胞也有表達（圖1），CD34陽性的血管內皮細胞胞質呈棕黃色顆粒（圖2）。caveolin-1在第2組和第1組中陽性表達率分別為65.0%和25.0%，MVD在第2組和第 1組中表達分別為 30.19±2.60和 21.34±4.62（P＜0.05）。caveolin-1陽性組和陰性組喉鱗癌組織中的MVD分別是27.88±6.04和 20.65±3.97，說明caveolin-1和 MVD 呈正相關（r=0.875，P＜0.05）。caveolin-1mRNA 在第 2 組和第 1 組中的表達分別為 0.701±0.073 和 0.450±0.050（圖 3），caveolin-1 mRNA表達增多與頸淋巴結轉移具有相關性（P＜0.05）。

3 討論

喉鱗狀細胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，伴有頸部淋巴結轉移是影響患者預后的重要因素。研究發現腫瘤內脈管系統參與腫瘤轉移過程，腫瘤血管不僅為腫瘤細胞快速生長提供養料和氧分，而且增生的新生血管增加了腫瘤進入脈管的機會，從而促進腫瘤細胞的轉移[2]。一些研究顯示，乳腺癌[3]、大腸癌[4]等腫瘤中，腫瘤內新生血管生成影響腫瘤的侵襲和轉移，腫瘤內微血管密度的增加與局部淋巴結轉移和預后密切相關。本研究也發現瘤內高表達MVD促進頸部淋巴結轉移，與上述觀點一致。瘤內微血管生成可能通過以下機制促進腫瘤淋巴結轉移：有充足血供的腫瘤細胞迅速增殖，與瘤周形成壓力差，促使腫瘤細胞進入瘤周微淋巴管形成淋巴結轉移。

caveolin-1是細胞膜上凹陷微區域caveolae的主要結構蛋白，其在腫瘤侵襲[5]和血管生成[6]中起重要作用。Yu等[7]發現caveolin-1的高表達可以促進肺癌的進展和轉移。Barresi等[8]研究也發現caveolin-1表達上調與腦膜瘤MVD呈正相關。在對腎透明細胞癌研究中，發現caveolin-1表達上調與腫瘤轉移密切相關，并與腫瘤微血管密度（MVD）呈正相關[9]。本研究結果表明，無論在蛋白水平還是基因水平，伴有頸淋巴結轉移組caveolin-1表達高于不伴有頸淋巴結轉移組，說明caveolin-1的表達與喉鱗狀細胞癌頸淋巴結轉移密切相關。

腫瘤的血管生成包括血管內皮細胞增殖、遷移和分化過程。Beardsley等[10]研究發現，caveolin-1具有促進內皮細胞遷移的功能，與血管生成有關。Liu等[11]發現caveolin-1表達與內皮細胞形成管狀結構有關：以腺病毒為載體在內皮細胞內高表達caveolin-1，內皮細胞分化成管狀結構增加3倍，而降低caveolin-1表達，則管狀結構數降低10倍以上。張志波等[12]研究發現caveolin-1基因沉默的人肝細胞癌株SMMC7721條件培養基能顯著降低HUVEC中eNOS ser-1177位點的磷酸化表達，從而抑制VEGF介導的eNOS活化引起的HUVEC管腔結構形成。本研究也顯示，瘤內caveolin-1表達增高與瘤內MVD表達升高具有相關性，提示caveolin-1可能通過誘導血管生成參與介導腫瘤的侵襲轉移。

綜上所述，caveolin-1可能與喉鱗狀細胞癌血管生成相關，進而促進喉癌侵襲和頸淋巴結轉移，但其具體作用機制仍需進一步研究。caveolin-1和MVD可能成為預測喉鱗狀細胞癌頸淋巴結轉移的指標。利用caveolin-1抗體阻斷喉癌血管生成可能成為抗喉腫瘤侵襲的有效手段之一。

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Relationship among the expression of the caveolin-1 and MVD with cervical lym ph nodesmetastasis in laryngeal squamous cell carcinoma

HUANGQingli,HUANGFUHui,SHIMin,JINYangzi
Departmentof Otolaryngology,the First Clinical Affiliated Hospital of ShanxiMedical University,Taiyuan 030000,China

Objective:To study the relation among the expression of the caveolin-1 and microvessel density(MVD)with cervical lymph nodesmetastasis in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC).Methods:The expression of caveolin-1 and CD34 in 40 samples of tumor were detected by immunohistochemical method.The expression of caveolin-1 mRNA in samples of tumor was detected by semi-RT-PCR technique.Results:The caveolin-1 mRNA A of LSCC without cervical lymph nodesmetastasis was(the first group)0.450±0.050,the caveolin-1 mRNA A of LSCC with cervical lymph nodes metastasiswas(the second group)0.701±0.073;the positive rate of the caveolin-1 protein expression in the first group was 25.0%,in the second group was 65.0%,caveolin-1 was higher either atmolecular level or at the protein level in the second group than the firstgroup(all P＜0.05).The expression ofMVDmarked by CD34 in the second group was 30.19±2.60,and in the first group was 21.34±4.62,the expression of MVD in the second group was higher than the first group(P＜0.05).The over expression of caveolin-1 had a positive correlation with a higher MVD and were both related to cervical lymph nodesmetastasis in the 40 cases(r=0.875,P＜0.05).Conclusion:These results suggest thatover expression of caveolin-1may play a very important role in themetastasisof laryngeal squamous cell carcinoma and is closely correlated with angiogenesis.

Caveolin-1;Laryngeal squamous cell carcinoma;Microvessel density;Lymphaticmetastasis

R739.65

A

1673-7210（2011）03（b）-025-03

黃清麗（1985-），女，河北臨漳人，碩士研究生，從事頭頸部腫瘤方向研究。

皇甫輝，主任醫師。

2010-01-04）