西羅莫司對減輕小口徑移植血管材料內膜增生的作用

馬曉華 ，王學寧 ，張順業 ，張 勇 ，郭曉亮 ，高 進 ，李天亮

1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西省心血管病醫院，山西太原 030001

西羅莫司對減輕小口徑移植血管材料內膜增生的作用

馬曉華1，王學寧2，張順業2，張 勇2，郭曉亮1，高 進1，李天亮2

1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西省心血管病醫院，山西太原 030001

目的：將脫細胞聯合肝素處理的小口徑異種移植血管進一步結合西羅莫司，以觀察術后移植血管內膜增生的情況。方法：將脫細胞聯合肝素處理的犬頸動脈進一步結合西羅莫司，并分為A組（對照組，脫細胞并結合肝素）和B組（西羅莫司組，脫細胞并結合肝素+西羅莫司處理）兩組。取健康家兔16只，隨機分為兩組（每組8只），利用兔頸動脈旁路移植模型，分別移植A組和B組的血管進行比較。術后分別于1、2、4、8周采血采用HPLC法檢測B組移植血管中西羅莫司的含量。術后3個月超聲檢測移植血管通暢情況，并取血管樣本經免疫組織化學和HE染色觀察內膜增生程度。結果：B組8周后仍可檢測到西羅莫司，且含量呈逐漸降低趨勢。術后3個月超聲顯示，A組部分血管（2/8）斑塊形成、管腔狹窄，B組血管無明顯狹窄（P＜0.05）。免疫組織化學檢測顯示，A、B兩組血管管壁均可見新生的內皮細胞和平滑肌細胞。HE染色提示，B組內膜增生程度較A組輕[A、B兩組內膜/中膜厚度比分別為（1.63±0.04）μm、（0.43±0.04）μm]（P＜0.05）。結論：在脫細胞結合肝素的小口徑異種移植血管上進一步結合西羅莫司可以有效減輕內膜增生。

西羅莫司；內膜增生；血管移植；小口徑

小口徑血管移植常因血栓形成、內膜增生等原因導致移植血管發生狹窄、閉塞。本實驗的前期研究中，將犬頸動脈脫細胞結合肝素處理構建出小口徑異種血管材料，并移植入兔頸動脈，術后6個月的觀察發現移植血管均無阻塞，通暢性較好，但部分血管內發現不同程度的內膜增生，導致管腔狹窄[1]。西羅莫司抑制血管內膜增生的作用已經在冠狀動脈藥物涂層支架及人工血管得到證實和廣泛應用[2-3]，本實驗在前期研究的基礎上，將脫細胞聯合肝素處理的犬頸動脈進一步結合西羅莫司，以觀察其抑制血管內膜增生和預防再狹窄的作用。

1 材料與方法

1.1 血管處理

成年犬8只（山西醫科大學動物實驗中心提供），體重15.4～18.2 kg，熱缺血時間小于5min，取雙側頸總動脈長約15 cm。小心浸泡于含抗生素（青霉素鉀1 000 U/ml和硫酸鏈霉素1 000μm/ml）的生理鹽水中備用。采用本實驗前期研究應用的方法對取下的犬頸動脈進行脫細胞和結合肝素處理[4-5]。處理后的血管分為兩組：A組（對照組，脫細胞并結合肝素）和B組（西羅莫司組，脫細胞并結合肝素+西羅莫司處理）。對B組血管進行結合西羅莫司處理[6-7]：將聚丙交酯乙交酯（Polylactide coglycotide，PLGA）和西羅莫司物理混和配制成溶液，用浸涂提拉法將血管材料浸入該溶液中，勻速拉出，反復3次，然后置于室溫下干燥直至溶劑完全揮發，此條件下使西羅莫司聚合物均勻結合在血管材料上。

1.2 移植實驗

家兔16只 （由山西醫科大學動物實驗中心提供），體重2.2～3.0 kg，雌雄不限，隨機分為兩組（每組8只）。利用兔頸動脈旁路移植模型，分別移植A組和B組的血管進行比較。

氯胺酮10mg/kg，地西泮2.5mg/kg，阿托品1.0 mg/kg肌內注射麻醉，耳緣靜脈建立輸液通路靜滴鹽酸氯胺酮30μg/（kg·min）維持麻醉。麻醉成功后將家兔仰臥位固定于手術臺上，取前正中切口，顯露左側頸總動脈，將移植血管分別與犬頸總動脈的近心端及遠心端用8-0 Prolene線做端側吻合，兩吻合口間距約4 cm，結扎吻合口之間犬頸總動脈，使血流僅通過移植血管。術后第1天恢復常規飼養，前3 d肌內注射青霉素80萬U預防感染并口服小劑量腸溶阿司匹林片。

1.3 檢測指標

1.3.1 西羅莫司的檢測 應用陳宏林等[8]報道的HPLC法在第1、2、4、8周測量B組移植血管中西羅莫司的含量。

1.3.2 超聲觀察 術后3個月將兩組兔麻醉后用HP Sonos 4500型超聲成像系統（探頭頻率10MHz）檢測移植血管通暢情況。

1.3.3 HE染色及免疫組織化學檢測 術后3個月處死動物，經原切口取移植血管標本做如下檢測。HE染色：標本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，垂直于移植血管長軸制成5μm切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察內膜和中膜厚度及內膜/中膜厚度比（I/M），取平均值作為標準數值。免疫組化染色：采用常規SP法，以Rabbit Anti-Ⅷ factor、Anti-Beta-Actin作為一抗 （購自北京博奧森生物技術有限公司公司），經過脫蠟至水、滅活、抗原修復、免疫組織化學染色、復染、脫水、封片等過程制成切片，在顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大體觀察

術中觀察移植血管彈性好，搏動良好，吻合口無滲血。術后觀察3個月，16只兔均成活，無偏癱，頸動脈搏動良好。

2.2 西羅莫司濃度檢測

B組術后1、2、4、8周均可檢測到西羅莫司，且含量呈逐漸降低趨勢（表1）。

2.3 超聲觀察

術后3個月發現部分血管內血栓形成，導致管腔狹窄，超聲觀察A組（對照組）血栓形成率為2/8，B組（西羅莫司組）為 0/8（P＜0.05）。

2.4 HE染色結果

術后3個月觀察發現，B組內膜厚度較A組明顯降低（P＜0.05），B組中膜厚度較A組差異無統計學意義，B組內膜/中膜厚度比顯著低于A組（P＜0.05）（表2）。免疫組織化學顯示A、B兩組血管可見新生內皮細胞。

表1 HPLC法測定血管壁中西羅莫司的藥物濃度（±s）Tab.1 The contentof Sirolimus was measured by HPLC(±s)

表1 HPLC法測定血管壁中西羅莫司的藥物濃度（±s）Tab.1 The contentof Sirolimus was measured by HPLC(±s)

注：與 A 組比較，*P＜0.01

指標 A組B組（周）1 2 4 8峰面積（mAus）濃度（ng/血管）0 0 350.62 948.55*260.12 800.37*140.52 411.59*22.41 62.85*對照品83.16 384.00

表2 移植血管內膜、中膜厚度及內膜增生程度（±s）Tab.2 Intimaland m edial thickness and intimalhyperplasia in the vascular xenograft(±s)

表2 移植血管內膜、中膜厚度及內膜增生程度（±s）Tab.2 Intimaland m edial thickness and intimalhyperplasia in the vascular xenograft(±s)

注：與 A 組比較，*P＜0.05

組別 血管數A組B組8 8內膜厚度（μ m）8 8±6 2 2±3*中膜厚度（μ m）5 4±5 5 1±3*I/M 1.6 3±0.0 4 0.4 3±0.0 4*

3 討論

冠狀動脈旁路移植術（CABG）中自體動、靜脈是理想的血管替代物，但材料有限，若患者合并大隱靜脈曲張、動脈粥樣硬化等都將限制其利用，且患者大多需要3支或3支以上的移植血管，部分還需要2次或2次以上的CABG，自體血管常無法滿足需要。本課題組的前期實驗[9]將犬頸動脈作為小口徑異種血管，采用酶-去污劑法進行脫細胞處理，并結合肝素，實驗證實脫細胞徹底，機械性能無明顯破壞；將構建的血管材料移植入異種（兔）頸動脈，通過超聲觀察發現，肝素的結合處理有助于對抗血栓形成，提高血管通暢率。

但部分血管內由于內膜增生使管腔發生狹窄，可能影響血管的遠期通暢性，進一步減輕內膜增生成為本實驗的主要研究方向。西羅莫司洗脫冠狀動脈支架已成功應用于臨床，大量研究證實明顯降低了支架置入后再狹窄的發生率[2，10]；也有研究將西羅莫司與人工血管結合，動物移植實驗顯示結合了西羅莫司的人工血管可以有效抑制內膜增生[11-13]。本實驗借鑒西羅莫司洗脫支架的方法，使西羅莫司均勻地結合在血管表面，脫細胞后的血管材料呈纖維網狀結構，西羅莫司溶液通過血管纖維孔洞滲透血管壁全層。降解實驗表明PLGA載西羅莫司的降解時間為3個月左右[6]。

血管壁平滑肌細胞的凋亡與增殖是內膜增生的重要原因。血管內膜增生有三個高峰：①血管中膜平滑肌細胞增生；②血管平滑肌細胞由中膜遷移至內膜；③內膜顯著增厚[14]。Poon等[15]報道西羅莫司通過阻止細胞有絲分裂過程中G1期向S期轉變，在體外可抑制人和大鼠的血管平滑肌細胞的增殖。它與胞質受體FK506結合蛋白FKBP12結合，特異性作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），使mTOR羧基末端發生磷酸化反應，失去分解活性，阻斷細胞周期G1期向S期的轉變，抑制細胞增殖和遷移。西羅莫司通過上述機制抑制血管內膜增生。

本實驗借鑒西羅莫司洗脫冠狀動脈支架的原理和技術，創新性地將西羅莫司結合到脫細胞并聯合肝素處理的犬頸動脈上，構建新型小口徑異種移植血管材料。在本實驗中，在B組1～8周均可檢測到西羅莫司，且濃度呈逐漸降低趨勢，提示西羅莫司在體內逐漸釋放，發揮作用。由免疫組織化學染色可見A、B兩組內均有新生的內皮細胞，且A組內膜增生程度大于B組，增生組織主要為新生的血管平滑肌細胞；由HE染色可見，B組I/M顯著低于A組。由此可見這種新型血管材料充分發揮了西羅莫司的抗平滑肌增殖與遷移作用及肝素的預防血栓形成作用，兩種藥物的作用可以相互補充，以達到抑制內膜增生與血栓形成的目的。

在小口徑血管移植中，對血管材料進行脫細胞結合肝素、西羅莫司處理后可以減少血栓的形成，降低血管內膜增生，提高血管的遠期通暢性，有可能成為小口徑血管移植材料的新型來源。

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Effect of Sirolimus on reducing the small diameter of graft intimal hyperp lasia ofmaterials

MAXiaohua1,WANGXuening2,ZHANGShunye2,ZHANGYong2,GUOXiaoliang1,GAOJin1,LITianliang2

1.ShanxiMedical University,Taiyuan 030001,China;2 Shanxi Cardiovascular Hospital,Taiyuan 030001,China

Objective:To observe the effect of intimal hyperplasia,Sirolimuswas integrated in the decellularized and heparinized small-caliber vascular xenograft.Methods:The decellularized and heparinized canine carotid arterieswere further integrated with Sirolimus,and were divided into Group A(Control group,decellularized and heparinized)and Group B(Sirolimus group,decellularized and heparinized+Sirolimus treatment).Sixteen rabbits were randomly divided into two groups (Group A and B,n=8).The grafts of two groups were transplanted respectively into the rabbits,using the rabbit carotid artery bypass graftingmodel.The content of Sirolimus wasmeasured by HPLC at 1,2,4,and 8 week in Group B,respectively.Results:Sirolimus was found in vascular wall of Group B at 8 week after implantation,and the content of Sirolimus declined during the 8 weeks.After 3 months ultrasound showed that plaque formation and vessel stenosis were found in some blood vessels of Group A(2/8),while Group B had no significant vessel stenosis(P＜0.05).Immunohistochemistry showed endothelial cells and smoothmuscle cellswere found in Group A and B.HE stain found that the intimal hyperplasia was lighter in Group B than Group A [thickness ratio of intima tomedia in two groups were (1.63±0.04)μm,(0.43±0.04)μm](P＜0.05).Conclusion:Sirolimus can reduce intimal hyperplasia in the decellularized and heparinized small-caliber vascular xenograft.

Sirolimus;Intimal hyperplasia;Vascular implantation;Small-caliber

R965

A

1673-7210（2011）03（b）-014-03

山西省青年科技研究基金資助項目（項目名稱：冠狀動脈旁路移植術中新型橋材料的探索；項目編號：2009021042-3）。

馬曉華（1983-），男，河北滄州人，畢業于河北醫科大學，醫學學士，山西醫科大學2008級在讀碩士研究生；研究方向：心肌保護。

王學寧（1977-），男，山西太原人，畢業于上海交通大學醫學院，博士學位，主治醫師。

2010-12-30）