高能聚焦超聲治療后兔VX2肝癌MR灌注加權成像與微血管密度比較*

廣州市第一人民醫院1.放射科;2.普外科(廣東 廣州 510180)

徐宏剛1 徐 波2 陳 亮1 江新青1

高能聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）是利用超聲波組織穿透性和聚焦性等物理特性，將體外低能量超聲波束聚焦在體內靶區，通過焦域處高能量超聲波產生的熱效應、空化效應及機械效應等，使局部產生高溫(≥65℃)，導致焦域區內細胞產生不可逆死亡、蛋白質變性和組織凝固性壞死，同時能破壞內徑<2mm的腫瘤滋養血管，而位于聲通道上的組織及焦域周圍的組織不會受到損傷[1,2]。VX2瘤株起源于Shope病毒誘發的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，經過72次移植傳代后正式立株。磁共振灌注加權成像（perfusion-weighted imaging，PWI）是近年來發展起來的磁共振新技術，能定量分析組織微循環血流灌注變化，反映腫瘤血流灌注情況，在檢出、監測腫瘤和評價治療效果等方面有重要價值。

材料與方法

1.1 建立動物模型 新西蘭大白兔15只，雌雄不限，體重1.5-2.5kg，由廣東省醫學動物中心提供。VX2瘤株購于廣西醫科大學。將瘤株接種于兔腹股溝區皮下或肌肉間，使之成瘤并以之傳代。3-4周后將兔全麻后無菌條件下剝離腫瘤，切開瘤體取靠近包膜的灰白色魚肉樣組織置于盛有生理鹽水(100ml含青霉素4萬u)中，剔除壞死組織及纖維組織，將瘤組織剪碎至約1mm3左右的小塊備用。于兔耳緣靜脈注入速眠新(0.2ml/kg)全麻后無菌條件下逐層開腹，暴露肝臟，以眼科鑷于肝左葉較厚處刺破肝組織并形成口小(3-5mm)底大(5-8mm)的“燒瓶”樣竇道,將2-3塊剪碎的瘤株植入其中，并以明膠海綿碎塊埋塞竇口。確切止血后回納肝臟，逐層關腹，注入青霉素8萬u/kg。術后三天常規注射青霉素和慶大霉素各4萬u/kg。2周后待腫瘤直徑≥1cm時麻醉后送入HIFU治療中心，行HIFU治療，單次治療，治療后送回動物中心飼養，于治療后14天再次行MR檢查，檢查完畢處死動物，取病理標本迅速固定于中性甲醛溶液中，石臘包埋后作CD34病理檢測。

圖1 T2WI壓脂瘤體呈相對稍高信號，信號較均勻，邊界尚清，肝內未見轉移灶。圖2、3 HIFU治療后的原始灌注圖及rHVB圖。圖4 治療后瘤體中央呈灰紅色或灰白色，腫瘤細胞壞死明顯，血管減少。圖5、6 左圖為治療前CD34染色圖片，可見微血管生成明顯，視野內血管腔多見；右圖為治療后CD34圖，可見治療區為大片無結構壞死區，無微血管生成。圖7 治療后治療區與非治療區的SRSmax值與MVD計數比較。

1.2 掃描方法 速眠新0.2ml/kg深度麻醉兔后，使用自制腹帶加壓固定，采用Philips 1.5T磁共振掃描儀，8通道膝關節掃描線圈，采用呼吸門控行常規T1W、T2W（橫斷、冠狀、矢狀）掃描后，行PWI掃描，PWI掃描采用EPI-SE序列、SENSE技術。掃描參數：TR2000ms，TE80ms，層厚2mm，間距0.3mm，NSA 2，視野(FOV)150mm，矩陣256×256。對比劑為釓雙胺注射液(Gd-DTPABMA)，劑量0.3mmol/kg，采用高壓注射器注射，掃描3個相位后注射對比劑。每只兔掃描獲得原始灌注圖數量920-1080張不等。

1.3 影像學分析 所有的灌注原始圖像均傳送至工作站用其配套軟件進行處理，分別測量治療后不同感興趣區（ROI）信號強度，以ROI內的信號強度平均值為基礎構建血流灌注的信號強度-時間曲線，分析ROI在治療后MR信號變化，計算最大信號下降斜率(maximal signal reduction slope， SRSmax)，并利用相關功能軟件繪制相對肝血容量(relative hepatic blood volume，rHBV)圖。

ROI測量方法：在腫瘤治療區和瘤旁肝實質各畫3個ROI(取平均值)，注意ROI應盡可能大包括欲測區，各相關數據直接從畫圖軟件右上角圖形視圖中獲取[3]。SRSmax計算公式為：SRSmax=(SIpre-SIp)/TTP，SIpre為PWI圖像穩定后至信號下降前的ROI信號強度的平均值，SIp為灌注峰值時刻的ROI信號強度值，TTP為達峰時間(ROI信號強度下降的開始時刻到降為峰值時刻之間的時間寬度)。

1.4 病理學檢測 腫瘤內MVD檢測采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidinperosida，SP)三步法，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色。所用一抗為抗CD34(武漢博士德公司，工作濃度1：50)。采用PBS液代替一抗作陰性對照，全部為陰性；采用已知MVD陽性的皮膚血管肉瘤標本取代VX2瘤組織作為陽性對照，全部為陽性。MVD計數參照文獻[4,5]方法進行，先在低倍鏡(×40)下全面觀察切片，選出血管密度區(即“熱點”)，后在高倍鏡(×400)下分別取3個視野計數微血管，以染成棕色血管內皮或內皮細胞束作為1條血管數，血管腔和腔內紅細胞不作為計數單位，與抗體起反應的巨噬細胞和漿細胞等在鏡下根據形態學差異予以排除，以3個高倍鏡視野的微血管平均數作為該切片MVD值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，不同ROI的SRSmax的比較采用單因素方差分析、非參數檢驗和t檢驗，判斷相關性采用Pearson分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

2.1 VX2瘤兔建模與生存情況15只VX2瘤兔均成功建模，術后14天掃描，發現腫瘤共18個，其中12只1個病灶，3只2個病灶，瘤體最大徑分別為（1.27±0.15）cm，瘤體平掃T1W為稍低信號，T2W為稍高信號，信號較均勻，部分邊界欠清楚。病灶局限于肝臟內，未見轉移（圖1）。治療后腫瘤體積均較前有所增大，治療后14天瘤體最大徑約（1.95±0.48）cm ，T2W信號不均勻，可見高、低混雜信號。2只荷瘤兔發現轉移灶，腹腔種植、腹水可見。

2.2 治療后兔VX2肝癌的PWI及MVD變化 治療后rHVB圖顯示VX2瘤治療區（即腫瘤實質區）灌注程度降低，其SRSmax值較治療前明顯下降；非治療區（即瘤旁肝實質）血流灌注未見明顯變化，其SRSmax值治療前后無明顯差異（圖2、3）。

2.3 病理改變 治療區肉眼觀察腫瘤血管減少，鏡下見毛細血管內皮細胞退化，細胞壞死明顯，瘤周見水腫和炎性反應。非治療區大體肉眼觀察見瘤體呈灰白色魚肉樣，表面血管增多增粗，鏡下腫瘤邊界不清，核大、分裂像多見，間質少，微血管豐富（圖4）。

病理檢測顯示CD34主要表達于兔肝VX2瘤血管內皮細胞,呈棕黃色、淺褐色；腫瘤區內巨噬細胞、漿細胞及腫瘤和瘤旁肝實質匯管區內少量血管亦偶有非特異性染色（圖5、6）。治療后治療區CD34低表達，MVD計數明顯低于非治療區（圖7）。

2.4 統計學結果 治療前瘤體實質區SRSmax值明顯高于瘤旁肝實質，治療后SRSmax值改變明顯，低于瘤旁肝實質（表1）；治療后不同ROI的SRSmax與MVD作方差齊性檢驗無統計學差異，進一步作直線相關分析，治療區SRSmax與MVD呈正相關（r=0.574，P=0.004）（表2）。

討 論

PWI可清楚顯示腫瘤微循環血流狀況，主要采用動態團注示蹤(dynamic bolus tracking,DBT)法，其基本原理來源于核醫學中的示蹤劑稀釋原理及中央容積定理，通過團注對比劑后，采用超快速成像技術，檢測對比劑首過組織時引起的局部信號強度改變，計算其T1、T2或重T2(T2*)弛豫率的變化，再通過適當數學模型變換得到組織血流灌注的定量信息，用于了解其血液動力學特征，評價微循環狀態[6,7]。

腫瘤血管生成是實體性腫瘤生長和轉移基礎[8]。肝癌具有很強的誘導血管生成能力,其血管生成程度與腫瘤的生長、轉移及預后密切相關,故本研究選擇ROI內MVD計數作為腫瘤血管生成、破壞的程度和范圍標記物進行病理檢測的結果認為較為可靠[8,9]，本實驗證明，無論治療前、后，不同ROI的灌注程度及范圍與MVD計數結果一致。治療前兔肝移植瘤治療區SRSmax明顯增高，且高于非治療區，說明腫瘤組織有較多的新生微細血管，血流灌注程度非常高，這也是腫瘤生長、轉移的前提。HIFU治療后治療區SRSmax明顯下降，其差異有統計學意義，同時病理檢測顯示CD34呈低表達，MVD計數較治療前明顯降低，與PWI表現一致，兩者呈正相關，這說明HIFU可以有效的破壞腫瘤的微血管，減少瘤體微血管形成，破壞腫瘤血管生成，從而減少腫瘤血供，達到滅活腫瘤的目的。

表1 兔肝VX2種植瘤治療組HIFU治療前、后SRSmax比較

綜上，PWI作為一種無創性功能成像方法，在臟器功能研究、病灶檢出、腫瘤性質、預測腫瘤療效及判斷預后等方面有巨大潛力，同時病理、影像學對照對于判斷腫瘤組織來源、血供情況等非常重要，SRSmax結合MVD可能作為評價腫瘤微血管生成、破壞的指標，但如何應用于臨床仍有待進一步研究。

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