四環素誘導的丙型肝炎病毒非結構蛋白5B穩定細胞株的構建和檢測

王耀輝，丁煥平，王燏嬋，袁正宏,,

1. 復旦大學上海醫學院教育部/衛生部醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032； 2. 復旦大學生物醫學研究院，上海 200032； 3.上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心，上海 201508

目前，全球約有1.7億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，約占總人口的3%[1]，且發病率越來越高，尤其是在發展中國家[2]。HCV感染個體后在宿主體內長時間保持低水平復制，與慢性肝炎、肝硬化及肝細胞肝癌的發生密切相關。目前尚沒有針對HCV的有效疫苗，治療方案主要是Ⅰ型干擾素與利巴韋林聯合應用，但只有一半左右患者對此有反應，且多伴有并發癥[3-5]。因此，對HCV復制、致病機制及抗病毒治療策略的研究尤為重要。

非結構蛋白5B(nonstructural protein 5B，NS5B)是RNA依賴的RNA聚合酶[6], 在HCV復制中發揮關鍵作用，長期以來一直被看作潛在的抗病毒靶點[7,8]。近年來，也有不少報道提示NS5B除作為聚合酶參與復制外，還通過與宿主蛋白直接相互作用參與調控病毒的生活周期和致病過程, 但詳細機制尚有待進一步闡明[9-13]。為進一步了解NS5B的功能及其對細胞的影響，我們利用可誘導的人肝母細胞瘤(HepG2)穩定細胞株(Tet-On系統)，構建了可由四環素誘導的NS5B穩定HepG2細胞株(HepG2 Tet-On NS5B)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

實驗用材料和試劑包括HepG2 Tet-on細胞(Clontech公司)；MEM、胎牛血清(Gibco公司)，不含四環素的胎牛血清(Clontech公司)，青霉素(1×105u/L)、鏈霉素(0.1 g/L)、多西環素(強力霉素)和 G418 (Sigma公司)，潮霉素B(Roche公司)；細胞培養瓶和培養板(Corning公司)；限制性內切酶(NEB公司、MBI公司)；轉染試劑FuGENE HD(Roche公司)；抗Flag 抗體和抗actin抗體(鼠源，Sigma公司)，抗NS5B 抗體(兔源，VIROGEN公司)；硝酸纖維素膜(0.22 μm， Schleicher & Schuell BioScience公司)；宿主菌TOP10F’(Invitrogen公司)；質粒抽提試劑盒(Qiagen公司、Macherey Nagel公司)。pcDNA3.1/3×Flag NS5B由本室構建。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和轉染HepG2 Tet-On細胞培養于MEM培養基(含15%胎牛血清、1×105u/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素、100 μg/ml G418、1×非必需氨基酸)中，置37 ℃、5% CO2培養箱內培養，2～3 d傳代1次。

將細胞鋪于35 mm培養板，約80%融合時更換新鮮培液，2 h后用脂質體(FuGENE HD)進行轉染：將2 μl FuGENE HD加入100 μl不含血清和抗生素的純MEM培養基中，混勻；然后加入1 μg質粒，混勻后室溫孵育20 min，將孵育好的混合物均勻加入細胞培養板中繼續培養。

1.2.2NS5B質粒的構建用帶四環素反應元件的 pTRE2hyg 作為載體，載體圖譜如圖1A所示。首先以pcDNA 3.1/3×Flag NS5B質粒為模板，將帶有3×Flag標簽的全長NS5B經聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增后插入pTRE2hyg 載體中(酶切位點：BamH I、NotI)。引物序列為：sense (5′-3′)- TTGGATCCATGG- CATCAATGCAGAAG；antisense (5′-3′)- AAGC- GGCCGCTCATCGGTTGGGGAGCAG。

1.2.3穩定細胞株的篩選將轉染了質粒24 h后的細胞用胰酶消化，并重新鋪于10 cm培養皿，待細胞貼壁后更換新鮮培養液，加入潮霉素B至終濃度為200 μg/ml，持續培養。若細胞出現死亡，即更換含潮霉素B的新鮮培養液。2周后克隆出現，挑取單克隆于48孔板培養，待細胞長滿后依次向24孔板、12孔板、6孔板和25 cm2培養瓶轉移。分出部分細胞進行誘導、鑒定。

1.2.4免疫熒光檢測將預處理的玻片放入24孔板，加入混勻的細胞懸液(0.5 ml)。待細胞貼壁生長適當時加入四環素誘導，在特定時間收集細胞。收集細胞時，用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗1次；加入3.5%聚合甲醛置室溫固定15 min，然后吸去固定液；加30 mmol/L甘氨酸終止反應5 min，PBS 洗3次，每次5min；加入0.1% Triton X-100置室溫穿透5 min，PBS洗1次；加入3% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h以上，然后加BSA稀釋的一抗(抗Flag抗體)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次；加入BSA稀釋的二抗(CY3耦聯的抗鼠IgG)，室溫孵育1 h以上，PBS洗 3次；用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染核2 min，最后Mowiol封片，置激光共聚焦顯微鏡(TCS-NT，Leica)下觀察。

A: The vector used in this study and its MCS sequence. B: Identification of NS5B fragments after digestion.

圖1構建克隆所用載體及構建后酶切鑒定

Fig.1ThevectorusedinthisstudyandtheidentificationofNS5Bfragmentsafterplasmidconstruction

1.2.5蛋白免疫印跡法標本經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后，電轉印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶﹝用含0.05% Tween-20的PBS(PBST)配制﹞封閉1 h以上，分別加抗Flag、抗NS5B、抗actin抗體，置濕盒內4 ℃過夜；然后以PBST洗膜3次，每次10 min；加入相應辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h以上，以PBST洗膜3次，每次10 min；行增強型化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)檢測(PerkinElmer公司)。

2 結果

2.1 質粒的鑒定

本研究選用帶四環素反應元件的 pTRE2hyg 作為載體，將構建好的pTRE2hyg 3×Flag NS5B經酶切(BamH I、NotI)后進行瓊脂糖電泳鑒定，在1.8 kb附近可見清晰的條帶(圖1B)。質粒擴增后經測序顯示正確(博尚公司)。

2.2 標簽抗體檢測穩定細胞中NS5B的表達

用FuGENE HD將構建好的pTRE2hyg 3×Flag NS5B質粒轉入HepG2 Tet-On 細胞，經潮霉素B篩選后建立穩定細胞株，并通過蛋白免疫印跡法檢測細胞株中NS5B的表達情況。細胞經不同濃度的多西環素誘導48 h 后，用標簽抗體(抗Flag抗體)檢測。結果發現多西環素濃度為0.01 μg/ml時，可檢測出NS5B蛋白表達；當多西環素濃度達到1 μg/ml時，蛋白表達量最高。而未誘導組沒有蛋白表達(圖2A)。另外，經1 μg/ml多西環素誘導，在不同時間點收集細胞后用蛋白免疫印跡法檢測，發現2 h即可檢測出蛋白表達。隨著時間推移，蛋白的表達量增高，24 h達峰值(圖2B)。

2.3 抗NS5B抗體檢測穩定細胞株中NS5B的表達

為進一步確認蛋白表達的特異性，用抗NS5B抗體做進一步檢測，方法同上。蛋白免疫印跡結果見圖3。與對照組相比，經不同濃度多西環素或不同時間誘導后，抗NS5B 抗體可清晰檢測到內源性NS5B蛋白的表達。

2.4 免疫熒光法檢測NS5B的表達及胞內定位

穩定細胞株經多西環素誘導48 h后，用免疫熒光法檢測NS5B的表達及其在胞內的定位。結果顯示，多西環素誘導后可觀察到NS5B的表達(圖4A，紅色)，主要分布于胞質且靠近核周，與以前報道一致[14]；而未誘導組沒有熒光信號(圖4A)。同時用蛋白免疫印跡法驗證NS5B 的表達(圖4B)。

A: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by doxycycline (Dox) at different concentrations, and then detected by Western blot with anti-Flag antibody. B: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by 1 μg/ml Dox and harvested at indicated time points, and then detected by Western blot with anti-Flag antibody.

圖2抗Flag抗體檢測NS5B的表達

Fig.2TheexpressionofNS5Bdetectedbyanti-Flagantibody

A: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by 1 μg/ml Dox and harvested at indicated time points, and then detected by Western blot with endogenous anti-NS5B antibody. B: HepG2 Tet-On stable cells expressing NS5B induced by Dox at different concentrations, and then detected by Western blot with endogenous anti-NS5B antibody.

圖3內源性抗體檢測NS5B的表達

Fig.3TheexpressionofNS5Bdetectedbyendogenousanti-NS5Bantibody

A: The expression of NS5B and its subcellular localization detected by immunofluorescence assay (63×). B: The expression of NS5B in A detected by Western blot.

圖4免疫熒光法檢測NS5B的表達及其細胞內定位

Fig.4TheexpressionofNS5Banditssubcellularlocalizationdetectedbyimmunofluorescenceassay

3 討論

自1989年HCV被鑒定以來[15]，一直受到人們的極大關注。HCV基因組可編碼結構蛋白(Core、E1、E2) 和非結構蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[16,17]。其中NS5B是RNA依賴的RNA聚合酶，參與病毒RNA的從頭合成。NS5B還通過與諸多宿主蛋白的直接相互作用發揮其在復制和致病過程中的功能，如與人囊泡相關膜蛋白相關蛋白A(human vesicle-associated membrane protein-associated protein A, hVAP-A)的結合參與復制復合體的形成[10]；與α輔肌動蛋白(α-actinin)相互作用可維持復制復合體的數目，并調節復制效率[11]；而與核仁蛋白(nucleolin)的相互作用，可調控病毒從復制到翻譯的轉換[12]。 這些相互作用與聚合酶活性和病毒復制密切相關。另有報道稱NS5B可與抑癌基因Rb相互作用，并使其經泛素蛋白酶體途徑降解或通過誘生干擾素影響細胞周期[13,18]；也可與毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)相互作用，參與DNA損傷和基因組穩定性的調控[19]，具體機制尚不完全清楚。因此，NS5B細胞株的建立，有助于深入了解NS5B與宿主蛋白的相互作用及參與病毒復制和致病的各個過程。

為探討目的蛋白在細胞中的作用，人們采用各種方法將外源基因導入細胞內，觀察其對細胞的影響。目前常用的有瞬時轉染法，主要包括磷酸鈣法、脂質體法及電轉染法；但這些方法尚存在穩定性差、操作步驟較繁瑣、陽性率低、細胞毒性高、費用較高等缺點。另外，穩定轉染也正越來越多被采用。在普通穩定細胞株的構建中，對照細胞株常為不包括目的基因的空載體，即插入基因組的DNA長度不一致，可能會影響結果且需要另外篩選。本研究在HepG2細胞中建立了可由四環素調控(Tet-On)的NS5B穩定細胞株。Tet-On (rtTA依賴)系統是目前常用的可控性誘導表達系統[20]，在四環素或四環素衍生物存在的情況下，轉錄因子rtTA與反應元件結合，從而使目的基因轉錄和翻譯。該細胞株經1次轉染，篩選成功后即可用低濃度的抗生素維持，可長期培養，費用低、穩定性好。需要目的蛋白表達時，只需在培養液中加入四環素進行誘導，理論上陽性率為100%。在不加四環素誘導時，可直接作為陰性對照。另外，該系統通過四環素的存在與否決定目的蛋白的表達，能盡量減少維持培養時外源蛋白對細胞本身的影響，且可通過加入四環素的濃度和時間對蛋白表達進行時間和量的控制。操作簡單、靈活，能適應不同條件的研究需要。鑒于Tet-On系統的諸多優點，其已被廣泛用于生命科學研究的各個領域，包括病毒學研究。Zhang等利用 Tet-On系統在HeLa細胞中研究柯薩奇病毒感染與蛋白未折疊反應和凋亡的關系[21]；Tang等也在HepG2細胞中建立了Tet-On HBx 穩定細胞株來研究HBx的功能[22]；另外，該系統也用于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的很多研究中。

本研究構建的HepG2 Tet-On NS5B穩定細胞株在誘導后可被標簽抗體和抗NS5B抗體檢測到，免疫熒光法進一步證實了NS5B存在于細胞質內，加入誘導劑后可便捷地對目的蛋白的表達進行時間和量的控制。該穩定株在未誘導情況下經CCK-8試劑盒檢測，細胞生長沒有明顯改變。另外，持續培養40代后的穩定株經多西環素誘導仍能用質譜鑒定出NS5B表達，說明其穩定性和特異性良好。應用該細胞株可檢測在不同誘導濃度或不同時間點NS5B表達對細胞內特定蛋白或信號通路的影響及細胞表型的變化；可通過免疫沉淀法沉淀與NS5B相互作用的蛋白，進一步質譜鑒定，從而發現一些新的蛋白；亦可用來驗證一些體外實驗結果，以便從細胞水平深入了解NS5B的功能，進一步闡明感染宿主后HCV的復制和致病機制。

[1] Hoofnagle J H. Course and outcome of hepatitis C [J]. Hepatology, 2002, 36(5 Suppl 1): S21-S29.

[2] Yang JD, Roberts LR. Hepatocellular carcinoma: A global view [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2010, 7(8): 448-458.

[3] Shimakami T, Lanford RE, Lemon SM. Hepatitis C: recent successes and continuing challenges in the development of improved treatment modalities [J]. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9(5): 537-544.

[4] Ascione A, de Luca M, Tartaglione MT, Lampasi F, di Costanzo GG, Lanza AG, Picciotto FP, Marino-Marsilia G, Fontanella L, Leandro G. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin is more effective than peginterferon alfa-2b plus ribavirin for treating chronic hepatitis C virus infection [J]. Gastroenterology, 2010, 138(1): 116-122.

[5] Feld JJ, Hoofnagle JH. Mechanism of action of interferon and ribavirin in treatment of hepatitis C [J]. Nature, 2005, 436(7053): 967-972.

[6] Lohmann V, Korner F, Herian U, Bartenschlager R. Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity [J]. J Virol, 1997, 71(11): 8416-8428.

[7] Jonckers TH, Lin TI, Buyck C, Lachau-Durand S, Vandyck K, van Hoof S, Vandekerckhove LA, Hu L, Berke JM, Vijgen L, Dillen LL, Cummings MD, de Kock H, Nilsson M, Sund C, Rydegard C, Samuelsson B, Rosenquist A, Fanning G, van Emelen K, Simmen K, Raboisson P. 2′-Deoxy-2′-spirocyclopropylcytidine revisited: a new and selective inhibitor of the hepatitis C virus NS5B polymerase [J]. J Med Chem, 2010, 53(22): 8150-8160.

[8] Vermehren J, Sarrazin C. New HCV therapies on the horizon [J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17(2):122-134. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03430.x.

[9] Walters KA, Syder AJ, Lederer SL, Diamond DL, Paeper B, Rice CM, Katze MG. Genomic analysis reveals a potential role for cell cycle perturbation in HCV-mediated apoptosis of cultured hepatocytes [J]. PLoS Pathog, 2009, 5(1): e1000269.

[10] Gao L, Aizaki H, He JW, Lai MM. Interactions between viral nonstructural proteins and host protein hVAP-33 mediate the formation of hepatitis C virus RNA replication complex on lipid raft [J]. J Virol, 2004, 78(7): 3480-3488.

[11] Lan S, Wang H, Jiang H, Mao H, Liu X, Zhang X, Hu Y, Xiang L, Yuan Z. Direct interaction between alpha-actinin and hepatitis C virus NS5B [J]. FEBS Lett, 2003, 554(3): 289-294.

[12] Shimakami T, Honda M, Kusakawa T, Murata T, Shimotohno K, Kaneko S, Murakami S. Effect of hepatitis C virus (HCV) NS5B-nucleolin interaction on HCV replication with HCV subgenomic replicon [J]. J Virol, 2006, 80(7): 3332-3340.

[13] Munakata T, Nakamura M, Liang Y, Li K, Lemon SM. Down-regulation of the retinoblastoma tumor suppressor by the hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(50): 18159-18164.

[14] Kim JE, Song WK, Chung KM, Back SH, Jang SK. Subcellular localization of hepatitis C viral proteins in mammalian cells [J]. Arch Virol, 1999, 144(2): 329-343.

[15] Alter HJ, Purcell RH, Shih JW, Melpolder JC, Houghton M, Choo QL, Kuo G. Detection of antibody to hepatitis C virus in prospectively followed transfusion recipients with acute and chronic non-A, non-B hepatitis [J]. N Engl J Med, 1989, 321(22): 1494-1500.

[16] Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr PJ, Weiner AJ, Bradley DW, Kuo G, Houghton M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(6): 2451-2455.

[17] Reed KE, Rice CM. Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties [J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2000, 242: 55-84.

[18] Munakata T, Liang Y, Kim S, McGivern DR, Huibregtse J, Nomoto A, Lemon SM. Hepatitis C virus induces E6AP-dependent degradation of the retinoblastoma protein [J]. PLoS Pathog, 2007, 3(9): 1335-1347.

[19] Ariumi Y, Kuroki M, Dansako H, Abe K, Ikeda M, Wakita T, Kato N. The DNA damage sensors ataxia-telangiectasia mutated kinase and checkpoint kinase 2 are required for hepatitis C virus RNA replication [J]. J Virol, 2008, 82(19): 9639-9646.

[20] Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Muller G, Hillen W, Bujard H. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells [J]. Science, 1995, 268(5218): 1766-1769.

[21] Zhang HM, Ye X, Su Y, Yuan J, Liu Z, Stein DA, Yang D. Coxsackievirus B3 infection activates the unfolded protein response and induces apoptosis through downregulation of p58IPK and activation of CHOP and SREBP1 [J]. J Virol, 2010, 84(17): 8446-8459.

[22] Tang H, Liu L, Liu FJ, Chen EQ, Murakami S, Lin Y, He F, Zhou TY, Huang FJ. Establishment of cell lines using a doxycycline-inducible gene expression system to regulate expression of hepatitis B virus X protein [J]. Arch Virol, 2009, 154(7): 1021-1026.