乙型肝炎病毒X蛋白對細胞凋亡的影響存在劑量依賴性

翟露露，劉晶，謝幼華

復旦大學上海醫學院教育部/衛生部醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

目前全世界有3.5億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者[1]，深入研究HBV相關疾病的致病機制仍然任重而道遠。HBV屬嗜肝DNA病毒科，其基因組為部分雙鏈環狀DNA。HBV DNA共有4個開放讀碼框架(open reading frame，ORF)，分別為表達外膜蛋白的preS/S基因、表達核心蛋白及e蛋白的C基因、表達聚合酶的P基因以及表達X蛋白的X基因[2]。

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是HBV表達的唯一非結構蛋白，大量研究提示其在病毒感染、復制、致癌等過程中可能發揮重要作用。HBx全長154個氨基酸，相對分子質量約17 000。HBx在肝細胞中的亞細胞定位也存在爭議，在細胞核或胞質中存在HBx均有報道[3-5]。在細胞內，HBx具有廣泛的生物學功能，可通過與多個細胞內轉錄因子如激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、AP-2、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、 CCAAT增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)、轉錄激活因子(activating transcription factor，ATF)/cAMP 反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)等相互作用，調控眾多細胞基因的轉錄；另一方面，HBx又可與多條信號轉導通路中的關鍵因子作用，從而影響細胞周期、細胞凋亡和自吞噬等多種生理過程的正常進行[6]。

研究HBx對細胞凋亡的影響可為探索HBV相關的肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)致病機制提供更多依據。但目前不同的實驗室存在不同的研究結果。有報道稱HBx可通過調節腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Fas、P53或轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)等發揮促凋亡的生物學功能[7-10]；而另一些實驗室發現，HBx可通過調節線粒體通透性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore)等途徑達到抑制凋亡的作用[11-13]。HBx對細胞凋亡的不同影響可能由2個原因造成，一是不同研究使用的細胞模型不同；二是HBx的表達水平不同。近來Bouchard等報道，HBx可在同一細胞模型中既促進凋亡又抑制凋亡，不同的效應與NF-κB活性的不同有關[14]。本研究中，我們發現HBx對細胞凋亡的雙向作用可能與其表達量有密切關系。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞株Huh7、人胚腎細胞株293T均由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1質粒構建pc-Flag-X及pc-Flag-X-GFP由本實驗室提供，其中HBx編碼序列位于Flag標簽序列的下游，原始克隆載體均為pcDNA3.1(Invitrogen公司)。表達紅色熒光蛋白的質粒pDsRed2-C1購自Clontech公司。

1.2.2細胞培養與轉染Huh7、293T細胞在DMEM培養液(含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、0.03%谷氨酰胺)中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞以1×106個/皿傳代于60 mm培養皿中，12 h后將脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)以2 μl脂質體∶1 μg質粒的比例與質?；旌?，加入不含血清的DMEM培養液中，8 h后換為含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。

1.2.3AnnexinV-FITC檢測Annexin V-FITC檢測試劑盒購自BD Biosciences公司(BD PharmingenTM)。轉染48 h后收集細胞，用預冷的磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次；用0.5%胰酶消化，1 ml DMEM培養液吹勻后形成單細胞懸液。凋亡檢測相關操作嚴格按照試劑盒說明書，最后于流式細胞儀中上樣分析。

1.2.4線粒體和胞質分離實驗主要采用線粒體分離試劑盒(購自普利萊基因技術公司)進行線粒體分離。消化細胞后，加入1.5 ml冰預冷Mito-Cyto Buffer，用間隙嚴密的研杵研磨細胞30次，4 ℃、800g離心5 min，收集上清液，并轉移至新的離心管。4 ℃、12 000g離心10 min，上清液含胞質成分，線粒體沉淀在管底，用50 μl Mito-Cyto Buffer 重懸線粒體。測定蛋白濃度后加入2×Loading Buffer，煮沸5 min，-20 ℃保存。

1.2.5免疫熒光檢測細胞轉染48 h后，用3.7%聚合甲醛固定10 min，0.5% Triton X-100作用10 min，含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Tween-20的PBS(PBST)封閉30 min。用含抗NF-κB抗體(1∶200稀釋)的PBST封閉2 h，PBST洗滌后用標記有紅色熒光的二抗(goat anti-rabbit IgG；Invitrogen公司)孵育1 h，PBST洗3次。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色，封片劑封片，顯微鏡下觀察。4 ℃避光保存。

1.2.6蛋白免疫印跡檢測樣品于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)梯度膠中電泳分離后，于轉膜槽中將蛋白轉移至硝酸纖維素膜；在含5%脫脂奶粉的PBST中阻斷1 h，一抗4 ℃結合過夜或室溫結合2 h，二抗于室溫結合1 h。壓片，顯影。其中抗Flag鼠單克隆抗體購自Sigma公司，抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)兔多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗細胞色素C鼠單克隆抗體購自BD公司，抗NF-κB兔多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

2 結果

2.1 不同轉染量的HBx在Huh7細胞中發揮的促進凋亡或抑制凋亡作用

2.1.1AnnexinV-FITC結果結果顯示，在細胞中轉染較高劑量(>4 μg/60 mm培養皿)的質粒DNA時，無論Huh7還是293T細胞的凋亡數量都明顯升高，這為研究HBx的表達量對細胞凋亡的影響提供了一個可用的系統。

將不同量的HBx表達質粒轉染Huh7細胞，同時共轉染表達DsRed的質粒，每個轉染的質粒總量通過加入克隆載體pcDNA3.1而調整到相同數量(8 μg)。流式細胞儀分析顯示(圖1)，在表達DsRed的細胞中，隨著HBx質粒轉染量的增加，凋亡細胞數量先減少、后增多。在0.25 μg、0.5 μg轉染量時，細胞發生凋亡的比例逐漸降低。當轉染量逐漸增大到1 μg、2 μg、4 μg時，凋亡細胞比例逐漸上升，甚至超過初始水平。提示轉染低劑量HBx表達質?？梢欢ǔ潭纫种萍毎蛲?，而轉染較高劑量反而促進細胞凋亡。

Huh7 cells were transiently transfected with pc-Flag-X and DsRed-C2 at different concentrations. Flow cytometric detections were performed after staining cells with Annexin V-FITC. Apoptosis rate was measured as representing apoptotic cells among cells expressing DsRed.

圖1AnnexinV-FITC檢測驗證HBx對Huh7細胞凋亡的影響存在劑量依賴效應

Fig.1Dose-dependentinfluenceofHBxonHuh7cellapoptosisdetectedbyAnnexinV-FITCstaining

2.1.2半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3降解體檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是檢測細胞凋亡的重要標記物，不論是內源性還是外源性凋亡都會引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 降解激活，所以可通過檢測其降解體(cl-cas3)的水平來跟蹤細胞凋亡情況。如圖2所示，當HBx表達質粒轉染量為0.5 μg時，cl-cas3蛋白水平達最低，之后隨著HBx質粒轉染量的增多，cl-cas3蛋白水平逐漸上升(圖2A)。

A: Caspase 3 cleavage. Huh7 cells were transfected with pc-Flag-X at different concentrations. The cleaved caspase 3 (cl-cas3) levels were detected by Western blot. B: Cytochrome C release. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. Actin and GAPDH were used as loading controls, respectively. One out of two tests is shown in this figure.

圖2蛋白免疫印跡法檢測轉染不同劑量HBx質粒的Huh7細胞中各種凋亡標記物

Fig.2DetectionofapoptosismarkersinHuh7cellstransfectedwithHBx-expressingplasmidatdifferentconcentrationsbyWesternblot

2.1.3細胞色素C自線粒體外漏通常細胞色素C集中在線粒體，但當細胞進入凋亡狀態，線粒體膜的通透性發生變化，細胞色素C會從線粒體進入胞質，因此成為檢測細胞凋亡的重要標記物。

將質粒轉染Huh7細胞后，進行線粒體和胞質分離，吸取胞質，用蛋白免疫印跡法檢測胞質中細胞色素C表達水平。結果顯示，隨著HBx轉染量增高，胞質中細胞色素C水平先下降、后上升。在0.5 μg轉染量時，胞質中細胞色素C的量降至最低。當轉染量逐漸增大到1 μg、2 μg、4 μg時，胞質中細胞色素C的量逐漸增加(圖2B)。

2.2 凋亡誘導劑作用下HBx影響Huh7細胞凋亡作用的劑量依賴效應

進一步研究在凋亡誘導劑喜樹堿(campothecin)存在時，轉染低劑量HBx表達質粒對細胞凋亡的抑制作用。喜樹堿是一種重要的抗癌藥物，許多實驗研究表明其可誘導多種細胞凋亡，作用機制主要是與細胞核內的拓撲異構酶I DNA復合體結合，導致雙鏈DNA發生斷裂。

將質粒轉染Huh7細胞，24 h后吸去培養液，加入含有1 μmol/L喜樹堿的DMEM培養液(1號培養皿除外)；繼續培養24 h后收集細胞，進行線粒體和胞質分離，檢測胞質中細胞色素C水平。結果顯示，在喜樹堿作用下，轉染低劑量HBx表達質粒時，胞質中細胞色素C水平明顯下降，且促進細胞凋亡的HBx劑量比不加喜樹堿時顯著增高，表現為HBx轉染量為4 μg時，細胞色素C的量才顯著增多(圖3)。

Huh7 cells were transfected with HBx-expressing plasmid at different concentrations. Cells were collected 24 h after treatment with 1 μmol/L campothecin. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. One out of two tests is shown in this figure.

圖3凋亡誘導劑喜樹堿作用下轉染不同劑量HBx質粒對Huh7細胞中細胞色素C含量的影響

Fig.3Dose-dependentinfluenceofHBxoncytochromeClevelincampothecin-treatedHuh7cellstransfectedwithHBx-expressingplasmidatdifferentconcentrations

2.3 不同轉染量的HBx對 293T 細胞凋亡存在類似效應

為驗證HBx對細胞凋亡存在劑量依賴效應是否是肝癌細胞的特有性質，我們選擇胚腎細胞293T，按2.1.1中相同條件進行Annexin V-FITC流式檢測，并按2.1.3中相同條件轉染質粒后檢測細胞質中細胞色素C 的含量。結果顯示，在293T中也存在相似結果(圖4)。

2.4 不同劑量的HBx 對NF-κB在細胞內分布的可能影響

Bouchard等發現，HBx對細胞凋亡存在截然不同的效應，這一看似矛盾的結果與NF-κB的活性有關。NF-κB只有入核才可抑制細胞凋亡發生，因此我們猜測不同表達量的HBx對細胞凋亡影響的不同作用可能與NF-κB的細胞內分布有關，即HBx的不同表達水平可能影響NF-κB的入核或出核。將pc-Flag-X-GFP質粒梯度轉染Huh7細胞，48 h后收集細胞，以抗NF-κB抗體檢測，用帶有紅色熒光的二抗作標記，顯微鏡下觀察。結果發現，NF-κB在不同劑量HBx作用下確實發生了細胞內定位的變化。NF-κB在未表達HBx-GFP時主要位于胞質中，核內幾乎沒有。當低劑量HBx-GFP質粒轉染細胞后，NF-κB入核。HBx-GFP的轉染量逐漸增高到4 μg時，細胞核已凝縮成團，而NF-κB在細胞核中分布存在明顯空洞(圖5)。

A: Annexin V-FITC staining. 293T cells were transfected as that in 2.1.1. Apoptosis rate was measured as representing apoptotic cells among cells expressing DsRed. B: Cytochrome C release. 293T cells were transfected as that in 2.1.3. Cytochrome C levels in cytosol were detected by Western blot. One out of two tests is shown in this figure.

圖4不同轉染量的HBx對293T細胞凋亡具有不同的影響

Fig.4Dose-dependentinfluenceofHBxon293Tcellapoptosis

3 討論

很多文獻報道HBx影響肝細胞凋亡的作用，但結果不盡相同，甚至相反。近年來，Bouchard等利用大鼠原代肝細胞進行研究，發現HBx對大鼠原代肝細胞的凋亡存在雙向(促進和抑制)作用，且這種雙向作用與NF-κB的活性狀態有關[14]；但作者并沒有對HBx自身的表達水平進行研究以探尋造成上述現象的原因。本研究發現，HBx對Huh7和293T細胞凋亡的雙向作用與HBx在細胞內的表達量相關。在原代肝細胞中是否也如此，還有待進一步的研究。

事實上，病毒蛋白對細胞凋亡的雙向作用在其他病毒中也有報道。研究發現，腺病毒表達的E1A與E1B蛋白既可促進凋亡又可抑制凋亡，乳頭瘤病毒中的E6與E7也存在類似現象。

106Huh7 cells were transfected with pc-Flag-X-GFP plasmid at different concentrations. Forty-eight hours after transfection, NF-κB P65 was detected by anti-NF-κB and confocal microscopy. The nuclei were stained with DAPI.

圖5HBx和NF-κB在Huh7細胞內的定位

Fig.5CellularlocalizationofNF-κBandHBx

由于細胞凋亡會使細胞產生一系列變化，包括染色質聚集、分塊以至斷裂，形成凋亡小體，線粒體膜通透性改變，內容物外漏，細胞膜外翻等。由于凋亡的發生是極其復雜的生物學現象，所以不能簡單通過單一的凋亡標記物來認定細胞凋亡的發生。本研究選擇了3種細胞凋亡的檢測方法(Annexin V- FITC檢測、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3降解體檢測和線粒體內細胞色素C水平檢測)，反復確定HBx對細胞凋亡存在雙向作用的現象。并且，在胚腎細胞株293T細胞中也得到類似結果，說明這一現象不具備肝癌細胞特異性。

肝癌的發生是一個慢性漸變、積累的過程，其致病因素多樣而復雜。在眾多誘發因素中，HBV的持續感染發揮著關鍵作用。在HBV表達的所有蛋白中，HBx在影響病毒感染、復制、致病等過程中發揮重要作用[6, 15]。有研究顯示，在HBV相關的慢性肝炎、肝硬化及肝癌患者的肝組織中可檢測到HBx持續表達[16-18]，并發現在HBV相關HCC患者的血清及肝組織中檢出HBx蛋白的陽性率要遠高于慢性乙型肝炎患者[19]。遺憾的是，在患者肝組織中對HBx表達進行定量極為困難。其原因：一方面，編碼HBx的0.8 kb mRNA的序列完全與3.5 kb病毒前基因組RNA重疊，無法設計特異性引物來檢測HBx mRNA水平；另一方面，HBx蛋白極易被宿主細胞內蛋白酶體降解[20]。目前針對HBx蛋白的抗體仍然存在特異度和靈敏度等方面的不足，導致很難做到定量檢測HBx蛋白水平。因此，對自然感染HBV狀態下肝細胞中HBx濃度范圍的檢測，還難以準確定量。

2001年有文獻報道，HBx在細胞內的分布可能與HBx的表達水平有關。當HBx極低表達時，HBx集中在細胞核內；HBx高表達時，HBx會在胞質中檢測到[3,4]。我們在實驗中也發現同樣現象(圖5)，另外伴隨著HBx定位的變化，NF-κB也發生細胞內分布的變化。我們推測，HBx可能與NF-κB存在直接或間接的相互作用。在HBx低表達時，HBx主要集中分布于細胞核，而NF-κB可與之相互結合被帶入核中發揮轉錄調控作用，進而抑制凋亡的發生；當HBx表達量逐漸上升，部分HBx出核，部分NF-κB也隨之出核，進而影響其他信號通路，可能拮抗了核內NF-κB抑制凋亡的作用，綜合表現為促進凋亡。這一推測還有待深入研究。

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