微小RNA對人類免疫缺陷病毒感染的影響: 飛向入侵者的子彈？

朱凌燕，仇超，徐建青1,,4

1. 上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心，上海 201508； 2. 溫州醫學院，溫州 325035； 3. 復旦大學生物醫學研究院，上海 201508； 4. 復旦大學上海醫學院教育部/衛生部醫學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

微小RNA(microRNA，miRNA)為一類長度21～24個核苷酸(nucleotide，nt)、內源性的非編碼RNA分子。它們能識別靶mRNA上特異性的結合位點﹝通常位于3′非翻譯區(untranslated region，UTR)﹞，并通過不完全的堿基配對與靶mRNA結合，引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后表達的調控[1,2]。miRNA具有廣泛的生物學功能，參與組織分化，細胞發育、凋亡，腫瘤形成等過程的調節[3]。有研究顯示，人體中大約92%的基因可能受miRNA調控[2]，miRNA在免疫系統中的功能受到廣泛重視。已有研究表明，miRNA在免疫系統的發育和免疫應答中起著重要的作用，不僅調節適應性免疫應答的中心元件，而且參與固有免疫反應[4]。不同于傳統的轉錄因子全開或全關的調節方式，miRNA通過非常短的作用位點進行調節，在作用位點調節1個或少數幾個堿基對就能起關鍵作用，因而miRNA更適合對免疫系統進行精細調節和定量調節[5]。miRNA在宿主對病毒的免疫反應、病毒的免疫逃逸等過程中發揮著重要作用，其與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的相互作用過程很好地體現了這一點。

1 宿主基因編碼的miRNA

miRNA在病毒與宿主相互作用過程中發揮著重要作用。最近研究表明，宿主miRNA可抑制或促進病毒復制[6]。當病毒侵入宿主后，宿主細胞表達一系列miRNA，形成自身防御體系。由于miRNA介導的RNA靜默不需要序列的完全互補，通常miRNA 5′端的2～8個堿基與mRNA的3′UTR互補配對即可[7]，所以1條miRNA可將多種mRNA作為靶位。因此，我們不難想象，在宿主miRNA抑制HIV表達的同時，病毒也會尋求一種方式來調節宿主miRNA的表達，以利于自身的復制。

1.1 宿主miRNA抑制HIV表達

Drosha和Dicer是miRNA成熟所必需的RNA酶。Triboulet等[8]利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調Drosha和Dicer的表達，發現HIV-1在外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的復制能力增強，表明宿主miRNA可抑制HIV-1復制。進一步研究發現，miR-17/92的表達量在感染HIV-1的Jurkat細胞中下調，這可能是病毒主動對抗miRNA對其復制抑制的結果。miRNA-17/92是一個多順反子miRNA簇，編碼miRNA-17-(5p/3p)、miRNA-18、miRNA-19a、miRNA-19b-1、miRNA-20a和miRNA-92-1。通過序列分析，并未在病毒基因組中發現miRNA-17/92的結合靶位，但在P300/CBP相關因子(P300/CBP-associated factor，PCAF，一種組蛋白乙酰基轉移酶)中存在miRNA-17-5p和miRNA-20的結合位點。PCAF是Tat蛋白的輔助因子，對HIV-1基因表達有重要意義。過表達miRNA-17-5p或miRNA-20能很好地抑制HIV-1復制，抑制miRNA-17-5p或miRNA-20表達能增加PCAF表達量和病毒產生，說明miRNA-17-5p和miRNA-20是通過下調PCAF表達量來抑制病毒復制的。

與miRNA-17/92相似，miRNA-198也是通過作用于細胞周期蛋白T1，間接抑制HIV-1復制[9]。細胞周期蛋白T1是RNA聚合酶Ⅱ的延伸因子——正性轉錄延伸因子b(positive transcription elongation factor b， P-TEFb，真核轉錄延伸因子)的調節亞基，也是Tat調節HIV-1 長末端重復序列(long terminal repeat，LTR)所必需的。在人的單核細胞中細胞周期蛋白T1 低表達，但是當細胞分化成巨噬細胞后表達量顯著升高。與之相對應，在單核細胞中HIV-1的復制受抑制，而隨著細胞周期蛋白T1在巨噬細胞中表達量上升，HIV-1也能自由復制。值得注意的是，盡管細胞周期蛋白T1在單核細胞中的表達量很低，但其mRNA水平并不低，這意味著細胞周期蛋白T1是在mRNA水平受抑制的[10,11]。Sung等[9]對miRNA從單核細胞分化為巨噬細胞過程中表達量的變化進行了分析，并對表達量明顯下調的miRNA進行靶位預測，發現包括miRNA-198在內的3條miRNA在細胞周期蛋白T1的3′UTR有結合位點。將這些miRNA的前體轉入293T細胞，發現轉入miRNA-198前體的293T細胞中細胞周期蛋白T1表達量下降，而mRNA水平未發生改變，說明細胞周期蛋白T1的3′UTR可能是miRNA-198的靶序列。將該蛋白的3′UTR分割成相互有重疊的4段(U3-1、U3-2、U3-3和U3-4)，分別連接至pGL3載體，其中U3-1和U3-4表達受抑制，從而證實了該推測[9]。在單核細胞中抑制miRNA-198表達，細胞周期蛋白T1表達量上升，而過表達miRNA-198能抑制單核細胞分化為巨噬細胞時細胞周期蛋白T1的表達。同時，過表達miRNA-198將抑制HIV-1前病毒的表達以及HIV-1的復制[9]。因此，miRNA-198通過抑制細胞周期蛋白T1的表達行使其抑制HIV-1復制的功能。

不同于上述miRNA間接的作用方式，一些miRNA能直接以HIV-1轉錄本為靶位。Hariharan等[7]同時運用4種預測軟件對miRNA在HIV基因組中的靶位進行預測，發現5個宿主miRNA在HIV基因組中存在靶位(表1)，其中miRNA-29a和miRNA-29b的序列很相似，它們很可能與HIV-1的nef區結合，而結合位點的序列在HIV-1不同亞型(A、B、C、D、F和H)中都是保守的。隨后他們通過引物延伸方法檢測miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c在不同細胞系中的表達，發現在HeLa細胞、PBMC中均有這些miRNA的表達，且表達水平相當[3]。將nef靶區插入熒光素酶的3′UTR，轉入HeLa細胞后發現熒光素酶活性下降了3倍左右，而熒光素酶RNA的含量并未發生改變，說明是在轉錄后水平發生的抑制。用反義寡核苷酸抑制miRNA-29a、miRNA-29b的表達，熒光素酶的活性獲得部分恢復，抑制miRNA-29a產生的作用更大些。過表達miRNA-29a能抑制Nef蛋白表達和HIV-1復制。最近研究發現，HIV-1感染者的T細胞存在高豐度的miRNA-29a，與未感染HIV-1 的 293T細胞相比，感染細胞中miRNA-29a表達量提高20%。抑制miRNA-29a可增加HIV-1的產量和感染力；反之，表達miRNA-29a的類似物則抑制病毒復制[12]，這與Hariharan等的結論相符。miRNA在行使功能時與RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結合，并在細胞質處理小體(cytoplasmic processing body，又稱P小體)聚集。為觀察miRNA-29a在HIV-1 mRNA與RISC、P小體相互作用中的功能，Nathans等[12]將miRNA-29a野生型和突變體轉染293T細胞，發現轉染野生型miRNA-29a的細胞中與Ago2(RISC重要組分)、RCK/p54(P小體重要組分)結合的HIV-1 gag mRNA的量均顯著高于轉染miRNA-29a突變體的細胞，說明miRNA-29a增強HIV-1 mRNA與RISC以及P小體的結合能力。同時，如果消耗P小體的結構蛋白會破壞P小體結構，并導致病毒產量和感染力的增加。

表1 宿主與病毒表達的miRNA的靶位(功能)

Tab.1 Targets (functions) of cellular miRNAs and virus-encoded miRNAs

miRNATarget (function)ReferencesCellular miRNAshsa-miRNA-17/92Downregulate PCAF, inhibit HIV-1 replication[8]hsa-miRNA-198Repress cyclin T1, inhibit HIV-1 expression and replication[9]hsa-miRNA-29a, bRepress Nef, inhibit HIV-1 replication[3,7]hsa-miRNA-149Vpr (predicted))[7]hsa-miRNA-378EnV (predicted))[7]hsa-miRNA-324-5pVif (predicted)[7]hsa-miRNA-28, 125b, 150, 223, 382Repress almost all HIV-1 encoded proteins, including Tat and Rev; involved in HIV latency[14,15]hsa-miRNA-155, 16, 181a, etc.Involved in the development and function of immune system[4]Virus-encoded miRNAsVmiRNA#1-5Proteins involved in signal transduction, protein synthesis, and degradation, DNA interference, etc.(predicted)[19]miRNA-TAR-3p, 5pHDAC-1-mediated repression of HIV expression; down-regu-late apoptotic genes, especially ERCC1 and IER3[18,21]HAA-miRNADownregulate IL-15, IL-2 receptor γ chain, IRAK1, and FM-RP (predicted)[26]HIV-1-miRNA-H1Induce knockdown of AATF; suppress genes encoding for Bcl-2, c-Myc, Par-4 and Dicer; downregulate miRNA-149[27]miRNA-N367HIV-1 promoter interference [29]miRNA-TAR2-3p, 5pNot verified[24]

HIV-1在靜息CD4+T細胞中潛伏是現有抗病毒藥物清除HIV-1的主要障礙，因為現有藥物只能作用于復制中的病毒[13]。因此，深入理解HIV-1如何維持潛伏對研發清除病毒庫的策略具有極為重要的意義。Huang等[14]發現，一些宿主miRNA與HIV-1的潛伏相關。將來自不同HIV-1毒株(NL-43、89.6、JR-CS、LAI.2和YU.2)的3′UTR插入pEGFP-C1載體上增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的3′UTR，發現帶有HIV-1 3′UTR的熒光強度低于空載體對照組，說明插入的片段很可能包含miRNA的作用靶位，且該靶位在不同毒株保守存在。將HIV-1 NL4-3序列 3′端1.9 kb片段切成6小段(A～F)，分別連接到pEGFP-C1載體，并轉染靜息CD4+T細胞，其中與B、D和F片段連接的EGFP表達量顯著下降，因此miRNA的結合位點可能就在這3個片段上。對B、D和F片段進一步分割至每個片段長40～76 nt，精確定位miRNA可能的結合位點。結合靜息CD4+T細胞和活化CD4+T細胞中miRNA芯片表達情況及miRNA結合位點的預測結果，發現miRNA-28、miRNA-125b、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382在靜息CD4+T細胞中表達量較高，且在B、D和F片段上有結合位點。用miRNA抑制劑抑制這5條miRNA的表達，結果無論是在轉染HIV-1克隆的靜息CD4+T細胞，還是在感染者來源的靜息CD4+T細胞中，HIV-1蛋白的表達量和病毒產量都增加。說明miRNA-28、miRNA-125b、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382能抑制靜息CD4+T細胞中HIV-1的復制，因而與HIV的潛伏有關。最近有研究表明，在新分離的PBMC中，抗HIV-1 miRNA(miRNA-28、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382)水平顯著高于單核細胞衍生的巨噬細胞。抑制這些miRNA在單核細胞中的表達可提高HIV-1的感染力，增加在巨噬細胞中的表達則抑制HIV-1的復制[15]，表明這些miRNA介導的固有免疫在保護單核-巨噬細胞免受HIV-1感染中發揮重要作用。

1.2 HIV感染導致宿主miRNA表達異常

在宿主miRNA抑制HIV表達和復制的同時，HIV采取某些方式主動抑制這些miRNA(如miRNA-17/92)。此外，HIV誘導某些抑制細胞基因miRNA的表達以利于自身存活。將轉染pNL4-3的HeLa細胞和對照一起進行miRNA芯片檢測，發現與未表達HIV的細胞相比，表達HIV的HeLa細胞中大多數miRNA是下調的，上調的miRNA極少見[6]。對感染HIV和未感染HIV的Jurkat細胞進行基因芯片分析，發現包括miRNA-122、miRNA-370、miRNA-373﹡和miRNA-297在內的11個miRNA上調，其中一半miRNA只在感染細胞中檢測到[8]。對HIV感染者和正常人PBMC中的miRNA進行基因芯片分析，發現miRNA-329、miRNA-126﹡和miRNA-424是上調的[16]。盡管還沒有這些上調的miRNA功能的相關報道，但它們很可能是HIV誘導的，并可能有利于增強HIV的復制能力、感染性或存活等，當然也不排除這些miRNA的上調是宿主主動抵抗HIV感染的結果。最近對HIV腦炎(HIV encephalitis，HIVE)的研究表明，Tat能夠解除特定miRNA的表達抑制，包括存在于主要皮質神經元的miRNA-128，而miRNA-128a能抑制突觸相關蛋白25 (synaptosomal-associated protein 25，SNAP25)的表達[17]。SNAP25作為可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor， SNARE)的組分之一，在突觸囊泡與質膜融合、觸發神經遞質釋放過程中起重要作用[18]。HIVE是HIV-1感染的臨床表現，可引起神經元損傷和功能紊亂。由于神經元很稀少，一旦感染HIV-1后，將接觸到細胞毒素、細胞因子及Tat等。用重組體Tat1-72處理E17大鼠的胚胎皮質神經元后進行基因芯片檢測，發現6個miRNA(miRNA-374、miRNA-128a、miRNA-128b、miRNA-100、miRNA-25和 miRNA-99a)上調，其中miRNA-100、miRNA-128a和miRNA-374上調的表達量被重復驗證，說明這些由Tat上調的miRNA極有可能與疾病進程有關。

2 HIV編碼的miRNA

HIV-1被證實能抵抗治療、逃避免疫應答、改變細胞免疫功能和避免感染細胞凋亡。病毒必須用其僅表達9個蛋白的有限基因組來完成這些功能，因此除需大量利用細胞途徑并破壞原有分子加工過程外，病毒自身基因組的miRNA也是一個操縱細胞功能的強有力工具[19]。

2.1 HIV miRNA作用于宿主細胞

Bennasser等[20]運用計算機預測，HIV-1可能編碼5個pre-miRNA，推測理論上能形成10條成熟的miRNA(VmiRNA#1～5)。將這些預測的miRNA序列與人基因組3′UTR序列數據庫進行比對，發現大量細胞mRNA是這些miRNA的靶位點。這些預測的靶位點與編碼蛋白激酶、離子通道、參與蛋白質合成與降解的蛋白質、生長因子以及DNA甲基化等的細胞基因有關。值得注意的是，VmiRNA#1和VmiRNA#5分別與隨后研究發現的2條反式激活應答(transactivation response，TAR)元件來源的miRNA重疊或部分重疊，意味著其他幾條預測的VmiRNA可能也存在并參與對病毒或宿主基因的調控。

TAR為長59 nt的莖-環結構，位于HIV-1轉錄產物5′LTR的R區，能被Tat、P-TEFb識別和結合，以增加病毒基因的轉錄[2]。TAR RNA結合蛋白(transactivation response RNA binding protein，TRBP)是Dicer所必需的輔助蛋白，也是RISC的重要組成部分，而TAR可通過消耗TRBP而使下游的Dicer-RISC復合體缺少TRBP[21]。這可能部分解釋了為何HIV-1感染的細胞中miRNA表達量大多是下調的。TAR除通過結合TRBP調節宿主miRNA表達外，其自身也能編碼miRNA。Klase等[22]檢測到CD4+T細胞系表達Dicer，在體外條件下中觀察到Dicer能結合TAR并將其裂解，形成TAR來源的miRNA。這種miRNA存在于感染HIV-1的細胞系以及感染者來源的T細胞中，能引起組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC-1)與病毒LTR結合，削弱病毒基因的表達，說明此病毒miRNA可能參與維持病毒的潛伏。隨后，Ouellet等[23]用RNA印跡、引物延伸和RNase保護實驗證明了2個TAR來源的miRNA，并將源于TAR莖左臂的miRNA命名為miRNA-TAR-5p，將源于右臂的命名為miRNA-TAR-3p，后者似乎優先在HIV陽性細胞中聚積。有學者推測，在HIV-2也存在TAR來源的miRNA：miRNA-TAR2-5P和miRNA-TAR2-3P。已有研究發現了124 nt的TAR2 RNA結構域，其很可能編碼miRNA前體。至于miRNA-TAR2的表達則有待確認[24]。最近研究發現，TAR miRNA的表達能使細胞免于凋亡，并且下調參與細胞凋亡的基因，尤其是ERCC1和IER3，TAR miRNA在調節蛋白表達時不影響mRNA水平[19]。由于TAR miRNA在病毒生活史各個階段均有表達，也可在潛伏感染細胞中檢測到[22]，所以TAR miRNA可通過延長感染細胞的存活時間以增加病毒的復制。

HIV反義起始啟動子(HIV antisense initiator，HIVaINR)元件來源于HIV-1 LTR區的TAR DNA，其自身能編碼蛋白。同時由于其反轉錄產物與所有HIV RNA轉錄物起始的約25個nt重疊，預示其具有調節自身基因表達的巨大潛能[25,26]。Ludwig等[26]運用M-折疊法分析HIVaINR，發現這種反義RNA能形成多種多樣的莖-環或發夾樣二級結構，這些二級結構可能是被命名為HAA-miRNA的病毒的miRNA(VmiRNA)前體。通過預測發現，白細胞介素15(interleukin-15，IL-15)、IL-2受體γ鏈、人脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)和IL-1受體輔助激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1， IRAK1)是HAA-miRNA的靶位[27]。其中IL-15對T細胞的成熟、自然殺傷(natural killer，NK)細胞的發育和存活及長期記憶細胞的存活有重要意義；IL-2受體γ鏈是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受體的共性元件，該受體的異常表達導致嚴重的T細胞和NK細胞缺陷；IRAK1是天然免疫的一個決定性信號傳遞介質[25]。因此，HAA-miRNA對IL-15、IL-2受體γ鏈、FMRP和IRAK1表達量的下調將對免疫系統造成損傷，并且有利于病毒在宿主中存活。FMRP是一種RNA結合蛋白，參與蛋白質合成和miRNA加工。HIV可利用HAA-miRNA耗盡FMRP以解除宿主處理病毒的miRNA機制[27]。盡管尚未證實這些HAA-miRNA的存在，但可以推測它與其他病毒一樣，有利于HIV存活。與TAR來源的miRNA不同，Kaul等[28]研究發現，HIV-1-miRNA-H1能誘導拮抗凋亡轉錄因子(apoptosis antagonizing transcription factor，AATF)基因下調約80%，導致編碼抑制凋亡的bcl-2基因和增殖相關的c-myc基因受抑制。由于AATF可通過Dicer基因啟動子區的E2F(高等真核生物的轉錄因子)調節Dicer的表達，因此AATF下調導致Dicer表達量下降。同時，HIV-1-miRNA-H1還能下調以HIV-1編碼的Vpr為靶位的細胞miRNA-149，并最終啟動人單核細胞的凋亡。

2.2 HIV miRNA作用于病毒本身

HIV-1的nef基因位于病毒基因組的3′端，并與3′ LTR部分重疊，它在病毒復制初始階段高表達。Nef是一個多功能輔助蛋白，在病毒復制中起重要作用。同時由于Nef能下調CD4、CD8以及主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子[25]，因此在發病機制方面起關鍵作用。幾個相關研究發現，nefRNA可能是一種調節HIV-1復制的順式調控因子，某些Nef變異體可抑制HIV-1復制[29-31]。Omoto等[32]通過研究來自持續感染HIV-1 ⅢB的MT-4 T細胞RNA發現，miRNA-N367可能是nef來源的抑制HIV-1復制的miRNA。miRNA-N367是一條來源于nef區的miRNA，在體外實驗中能阻斷HIV-1nef表達，在人和15-2-2 模型小鼠體內也能抑制nef表達。與傳統的miRNA作用方式不同，miRNA-N367并不在轉錄后水平影響基因表達，而是通過干擾啟動子在轉錄水平起作用。將pH1-miRNA-N367、pCD-Tat以及含有HIV-1 LTR全長的Luc質粒(pLTRSF2)或U3區負向反應元件(negative responsive element，NRE)缺失的Luc質粒(pLTRSF2-105)轉染Jurkat細胞，48 h后檢測Luc熒光強度，發現在miRNA-N367的作用下含有NRE的pLTRSF2質粒轉錄活性下降約40%，而NRE缺失的pLTRSF2-105質粒轉錄活性沒有顯著變化。在pHILL質粒的Luc基因下游插入nef基因﹝pHILL(+)﹞，或反向插入nef作為陰性對照﹝pHILL(-)﹞。在不表達miRNA-N367的情況下，與轉染pLTRSF2的細胞相比，轉染pHILL(+)的細胞內Luc活性降低約60%；在表達miRNA-N367的情況下，降低約80%。而轉染pHILL(-)的細胞內Luc活性沒有顯著改變。說明miRNA-N367通過5′LTR區的NRE和3′UTR區的nef序列抑制HIV-1啟動子的活性[33]。盡管miRNA-N367起作用的精確機制有待研究，但可以推測miRNA-N367能抑制HIV-1復制，并允許持續低致病性或潛伏病毒感染。由于nef基因在HIV-2中保守存在，因此HIV-2可能通過同樣的機制在宿主中保持低調。

3 結語

HIV-1是慢病毒的一個亞類，能感染分裂和不分裂的細胞，在病毒RNA基因組反轉錄后整合到宿主染色體中。若不產生病毒顆粒則進入潛伏階段，此時病毒仍然存在于靜息的CD4 T細胞中，躲避宿主免疫監督和抗病毒藥物治療。當靜息細胞被激活，就能產生感染性的病毒顆粒。許多控制HIV潛伏的因子仍未知，而現有的大部分治療方案無法清除細胞內潛伏病毒儲存庫。完全互補的反義miRNA抑制劑能阻斷miRNA的抑制效應，并且在不激活細胞的情況下驅使病毒產生[34,35]，這對接受高效抗反轉錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)的個體具有重要意義。然而，宿主miRNA與HIV的相互作用是復雜的：宿主miRNA可抑制HIV表達(如miRNA-17/92、miRNA-198和miRNA-29a等)，HIV感染也可導致宿主miRNA異常表達(如miRNA-122、miRNA-370和miRNA-128等)。不同miRNA調節的方式也不盡相同：以成簇或單獨或三聚體形式間接或直接作用于病毒[8,12,36]。病毒miRNA的存在及最近研究發現的HIV-miRNA-H1的可演化性[37]更增加了整個調控網絡的復雜性。因此，有必要深入研究miRNA在HIV生活史中的作用及其機制，這不僅有助于鑒定調節HIV表達的新靶標，而且有助于建立有效的miRNA新療法。

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