2010年夏季急性細菌感染性腹瀉患兒沙門菌感染分析

王愛敏, 何磊燕, 許學斌, 宋建明, 薛建昌, 王傳清

1. 復旦大學附屬兒科醫院，上海 210102； 2. 上海市疾病預防與控制中心，上海 200336

沙門菌(Salmonella)是一種重要的通過食物傳播的病原菌，可引起人類傷寒、副傷寒、食物中毒、胃腸炎、敗血癥和局部感染等多種疾病。在某些情況下，尤其是在兒童、老年人和免疫缺陷患者中，非傷寒沙門菌(non-typhoidalSalmonella，NTS)導致的侵入性和病灶性感染十分嚴重[1]。沙門菌病是世界 各地的常見病和多發病，歐美地區發病率為10/10萬～83/10萬[2]。目前已知的沙門菌血清型有2 587種[1]，且抗原變異多。不同血清型沙門菌對抗菌藥物的敏感度存在差異。為了解本院沙門菌感染的現狀及耐藥特點，我們對2010年夏季急性細菌感染性腹瀉患兒進行腸道沙門菌感染監測，并對該菌的耐藥性進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2010年7月1日～9月30日復旦大學附屬兒科醫院門診及住院急性細菌感染性腹瀉患兒糞便標本，進行沙門菌分離、培養和鑒定。兒童急性細菌感染性腹瀉的診斷標準為：大便形狀改變，呈稀便、水樣便、黏液便或膿血便，大便次數比平時增多，病程在2周內。糞便常規檢查發現白細胞增多或有吞噬細胞[3]。患兒均為發病當日或次日就診, 就診前未使用過抗生素。

1.2 方法

1.2.1 分離、培養及生化鑒定[2]采用沙門菌直接篩選、分離、培養結合增菌的培養法。材料包括木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉(xylose-lysine-desoxycholate，XLD)瓊脂平板、亞硒酸鹽煌綠(selenite brilliant green, SBG)增菌液肉湯、沙門菌顯色平板(CHROMAgar Salmonella，CAS)顯色培養基、腸道綜合發酵管等，由上海美翔生物技術有限公司提供。將新鮮糞便拭子接種于XLD瓊脂平板，然后將糞便拭子放入SBG液體培養基中充分攪動后取出；將XLD分離平板和SBG增菌管置37 ℃溫箱培養18～24 h，挑取XLD平板中心黑色邊緣較透明或淺紅色的可疑菌落接種于CAS平板和雙糖管中，置37 ℃溫箱培養18～24 h，進行初步沙門菌鑒定；同時將培養過夜的SBG增菌液轉種到XLD平板，采取同樣的培養條件及初步鑒定法對沙門菌進行再次篩查、培養及鑒定。沙門菌在CAS平板呈酒紅色，糖初篩試驗符合K/A、H2S+/-、動力+、吲哚-、蔗糖-。采用血清學凝集試驗進行確診及血清型分型。

1.2.2 血清學分型試驗 用針對沙門菌群(A～F)抗原、菌體(O)抗原及鞭毛(H)抗原的不同抗血清對沙門菌進行血清型鑒定。方法為挑取雙糖斜面上少量菌苔與A～F多價抗血清在室溫下進行玻片凝集，1 min內出現凝集顆粒為陽性；按同樣方法與O單價抗血清進行逐一凝集來確定O抗原，根據確定的O抗原進行相應的H多價和單價血清凝集以確定最終血清型。玻片凝集時需設生理鹽水對照和標準菌株對照。標準菌株為ATCC 14028。沙門菌診斷血清為蘭州生物制品研究所和寧波天潤生物技術有限公司產品。

1.2.3 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer紙片擴散法。藥敏試驗用MH瓊脂平板為上海祥和生物有限公司產品。質控菌為ATCC 25922。根據2010年中國CHINET細菌耐藥性監測網對沙門菌的監測要求，選擇12種抗菌藥物：氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢曲松、環丙沙星、阿奇霉素、氯霉素、磺胺甲基異唑-甲氧芐啶、阿莫西林-克拉維酸、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢美唑和磷霉素。抗菌藥物紙片為英國Oxoid公司或美國BBL公司產品。按美國臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2009年M100-S19標準判斷結果[4]。

1.3 統計分析

采用WHONET5.3分析細菌對抗菌藥物的耐藥性，組間差異采用SPSS16.0 χ2檢驗。

2 結果

2.1 不同年齡組患兒沙門菌分離率

患兒年齡0～16歲。于2010年7月1日～9月30日收集門診及住院急性細菌感染性腹瀉患兒糞便標本1 045例，共分離出沙門菌160株，總分離率為15.3%。其中收集<1歲患兒糞便標本505例，分離出沙門菌119株，分離率為23.6%；收集1～5歲患兒糞便標本423例，分離出沙門菌32株，分離率為7.6%；收集>5歲患兒糞便標本117例，分離出沙門菌9株，分離率為7.7%。

2.2 沙門菌血清分型

對分離出的160株沙門菌進行血清學分型實驗，共鑒定出21種沙門菌血清型，另有4株暫未鑒定到種。其中鼠傷寒沙門菌65株，占40.6%；腸炎沙門菌40株，占25.0%。兩者共占65.6%，為主要的沙門菌株。少見的沙門菌有阿爾巴尼沙門菌、伊魯慕沙門菌、巴雷利沙門菌、羅森沙門菌、姆班達卡沙門菌、奧道奈茲沙門菌等。有4例沙門菌未鑒定到種。菌種分布見表1。鼠傷寒沙門菌中，<1歲患兒46例，占70.8%；1～5歲患兒15例，占23.1%；>5歲患兒4例，占6.2%。<1歲患兒感染鼠傷寒沙門菌的比率與1～5歲患兒和>5歲患兒相比，有顯著性差異(χ2=121，P<0.001)。腸炎沙門菌中，<1歲患兒19例，占47.5%；1～5歲患兒16例，占40%；>5歲患兒5例，占12.5%。年齡分布亦有明顯差異(χ2=78，P<0.001)。

表1 臨床分離沙門菌的菌種分布

Tab.1 Distribution of clinical isolates ofSalmonellaspp.

Microorganism Number of strainsPercent (%)Salmonella typhimurium6540.6Salmonella enteritidis4025Salmonella agona85Salmonella saintpaul53.1Salmonella meleagridis53.1Salmonella senftenberg42.5Salmonella paratyphi B42.5Salmonella infantis42.5Salmonella irumu31.9Salmonella aberdeen31.9Salmonella thompson21.3Salmonella stanley21.3Salmonella derby21.3Salmonella braenderup21.3Salmonella anatum10.6Salmonella potsdam10.6Salmonella albany10.6Salmonella bareilly10.6Salmonella rissen10.6Salmonella mbandaka10.6Salmonella ordonez10.6Salmonella spp.42.5Total160100

2.3 2種常見沙門菌對抗菌藥物的耐藥性

鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌對氨芐西林的耐藥率分別高達91.4%和69.0%；對第3代頭孢菌素的耐藥率，鼠傷寒沙門菌接近30%，而腸炎沙門菌不超過7%；鼠傷寒沙門菌對磺胺甲基異唑-甲氧芐啶耐藥率亦高達82.8%，對含酶抑制劑青霉素類、氯霉素及磺胺甲基異唑-甲氧芐啶的耐藥率均高于腸炎沙門菌；2種沙門菌對喹諾酮類、大環內酯類、頭霉素類、磷霉素及頭孢哌酮-舒巴坦的耐藥率均較低(表2)。結果顯示，鼠傷寒沙門菌對以上12種抗生素耐藥率在3個年齡組中的分布均有顯著性差異(P<0.001)，腸炎沙門菌對以上12種抗生素耐藥率在3個年齡組中的分布也有顯著性差異(P<0.001)。在鼠傷寒沙門菌中，發現3例廣泛耐藥菌株，其對氨芐西林、第3代頭孢菌素、喹諾酮類、大環內酯類、頭霉素類藥物均耐藥。未發現廣泛耐藥的腸炎沙門菌。

3 討論

腹瀉是兒童常見疾病，尤其在發展中國家。據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)估計，發達國家每年約30%的人患食源性疾病[5]；發展中國家更嚴重，估計每年腹瀉及相關疾病有217億病例，導致240萬5歲以下兒童死亡。美國于1996～1999年調查的7種(空腸彎曲菌、大腸埃希菌O157：H7、沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌、李斯特菌和小腸結腸炎耶爾森菌屬)細菌性食物中毒中，沙門菌位居第2位(33%)。1989～1990年日本檢出結果顯示，沙門菌占腸道病原菌的首位。我國多年來沙門菌食物中毒一直居細菌性食物中毒的首位(64%)[2]。我院調查也顯示，2010年夏季急性細菌性腹瀉患兒中沙門菌感染率超過15%。

沙門菌感染全年均可發病，夏季是感染高峰，嬰幼兒是易感人群。有報道顯示，在沙門菌感染病例中，<1歲患兒占81.4%[6]。本次資料顯示，在所有沙門菌感染病例中，<1歲患兒占74.4%(119/160)，符合沙門菌感染的患者年齡特征。

表2 沙門菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率

Tab.2 Sensitivity and resistance rates ofSalmonellaspp. to antimicrobial agents

AntibioticSalmonella typhimuriumS(%)R(%)Salmonella enteritidisS(%)R(%)Salmonella spp.S(%)R(%)Ampicillin8.691.431.069.067.532.5Ampicillin-sulbactam17.550.975.9075.012.5Cefotaxime62.129.389.76.982.512.5Ceftriaxone65.529.393.16.985.015.0Ciprofloxacin48.36.996.6090.010.0Azithromycin83.38.386.710.389.310.7Chloramphenicol31.06993.13.477.520.0Sulfamethoxazole-trimethoprim17.282.889.710.356.441.0Amoxycillin-clavulanic acid34.536.279.3072.520.0Cefoperazone-sulbactam79.3089.701000Cefmetazole93.16.9100095.55.0Fosfomycin100010001000

S, sensitivity rate; R, resistance rate.

自1993年以來，非傷寒沙門菌感染以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主[7]。此次調查共分離到21種血清型，其中鼠傷寒沙門菌占40.6%、腸炎沙門菌占25.0%，兩者占總分離率的65.6%。深圳于2009年分離到的沙門菌中，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌占58.8%[8]。2008年北京夏季沙門菌感染中，亦以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主，共占71.06%[9]。提示我國目前流行的沙門菌血清型為鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。<1歲患兒感染鼠傷寒沙門菌的比率明顯高于1～5歲和>5歲患兒。此次分離到6種少見的血清型，有4種沙門菌未鑒定到種。

沙門菌是人畜共患病的致病菌。長期以來，為治療、預防疾病和促進畜禽生長，抗生素廣泛添加到動物飼料中，致使沙門菌耐藥性不斷上升。耐藥的沙門菌通過畜禽再傳播給人類，已成為嚴重的公共衛生問題。特別是鼠傷寒沙門菌對氯霉素、氨芐西林等普通抗生素及磺胺類藥物普遍耐藥，對氟喹諾酮類藥物耐藥的病例亦日益增多，對第3代頭孢菌素亦出現耐藥。在歐洲，40%的沙門菌分離株至少對1 種抗生素耐藥，18%的分離株為多重耐藥(muitidrug resistance，MDR)表型[10]。在非洲，沙門菌對氯霉素、磺胺甲基異唑-甲氧芐啶、氨芐西林的耐藥率為36%～59%[11]。國內一項調查顯示，2003～2008年鼠傷寒沙門菌對氨芐西林的耐藥率從4.4%增至51.4%，對頭孢噻肟的敏感率從100%降至82.8%，對磺胺甲唑/甲氧芐啶的敏感率從100%降至52.8%[12]。一項上海市鼠傷寒沙門菌流行研究顯示，鼠傷寒沙門菌臨床病例腹瀉株在2005～2007年對磺胺類藥物的耐藥率從17.4% 上升至35.5%，多重耐藥株從2005年的1株上升至2007年的6株，對第3代氟喹諾酮類藥物也有5.7%～9.7%的低水平耐藥，對第3代頭孢菌素未見耐藥[13]。而在本次研究中，鼠傷寒沙門菌的耐藥率普遍高于其他沙門菌。其對氨芐西林的耐藥率已高達91.4%；對磺胺甲基異唑-甲氧芐啶耐藥率亦高達82.8%；對第3代頭孢菌素如頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥率也接近30%；對環丙沙星呈低度耐藥，耐藥率為6.9%。沙門菌對頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢美唑、磷霉素仍高度敏感。

目前多重耐藥菌十分猖獗，多重耐藥的發生率近年來顯著增長，原因之一就是具有多重耐藥性的鼠傷寒沙門菌DT104在全球范圍內傳播。沙門菌的耐藥性主要由質粒介導，其多重耐藥性的獲得主要與質粒基因和染色體基因突變有關。多重耐藥的水平轉移通常是由質粒、轉座子或整合子內的基因盒介導。高耐藥和多重耐藥鼠傷寒沙門菌(如DT104) 的出現是多種耐藥機制協同作用的結果。質粒介導耐藥性使耐藥菌株迅速擴散、蔓延，導致防治困難，因此細菌的高耐藥率亟待解決[14]。耐藥細菌通常通過食物鏈傳播給人[15]，因此動物源性沙門菌新的耐藥機制的出現，將直接決定人源性沙門菌的耐藥性。我們必須積極開展沙門菌耐藥機制研究和流行病學調查，遏制不合理的抗生素應用，持續監測沙門菌的耐藥性變化。臨床醫師在選擇藥物時，應主要參考本地區某一時段的耐藥性監測結果，制訂治療方案，避免盲目使用及濫用抗生素。

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