現(xiàn)用梅毒血清試驗臨床應(yīng)用價值評估

龔匡隆，尤永燕，張津萍，沙仲，孫厚華

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所, 南京 210042

梅毒(syphilis)是我國乙類傳染病中重點防治的疾病。當(dāng)人體感染梅毒螺旋體(Treponemapallidum，TP)4～10周后，血清中可產(chǎn)生抗類脂抗原的非特異性反應(yīng)素和抗TP抗原的特異性抗體(IgM/IgG)。正規(guī)治療可控制炎癥，消除損害，防止進一步發(fā)展；同時患者體內(nèi)IgM和非TP血清抗體逐步下降直至轉(zhuǎn)陰，達到臨床和血清學(xué)意義上的痊愈。血清抗體的梅毒實驗室檢測對臨床診斷及療效監(jiān)測具有重要意義。本文采用TP-IgM酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(TP-IgM ELISA)、快速血漿反應(yīng)素(rapid plasma reagin，RPR)環(huán)狀卡片試驗、TP明膠凝集試驗(Treponemapallidumparticle assay，TPPA)3種實驗方法，觀察135例梅毒患者正規(guī)治療前、后血清抗體的變化，探討梅毒血清試驗對梅毒診斷和隨訪的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 病例

135例梅毒患者均來自我院性病科，診斷標準依據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準》(WB273-2007)。其中男性108例、女性27例；平均年齡36歲(20～42歲)；24例為一期梅毒患者(硬下疳，均為男性)，93例為二期梅毒患者(其中女性27例)，18例為早期潛伏梅毒患者(均為男性)。收集正規(guī)治療前、后梅毒患者血清進行檢測。由于梅毒合并人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的患者較多，臨床表現(xiàn)和血清抗體變化較復(fù)雜。為排除影響RPR試驗和TP-IgM ELISA的多種因素，本研究采用HIV 1+2型抗體診斷試劑，選取HIV陰性梅毒患者作為研究對象。

1.2 檢測方法

1.2.1RPR試驗——梅毒篩查試驗TP感染后，人體迅速對TP表面的脂質(zhì)發(fā)生免疫應(yīng)答，3～4周產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體(反應(yīng)素)。這些抗體主要成分是IgM/IgG混合抗體。抗原和抗體混合時，由于搖動、碰撞，形成肉眼可見的絮狀沉淀反應(yīng)，即為陽性；反之則為陰性。①定性試驗：吸取0.05 ml血清或血漿，均勻涂布在整個反應(yīng)卡片圈內(nèi)，加入搖勻的抗原1滴(約0.016 7 ml)，置水平旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)8 min 〔(100±2)r/min〕，立即在強光下觀察結(jié)果。圓圈內(nèi)出現(xiàn)小、中到大的黑色絮狀物，液體清亮為陽性；圓圈內(nèi)僅見碳顆粒集于中央一點或均勻分散為陰性。②定量試驗：吸取0.05 ml血清或血漿，以等滲鹽水系列稀釋至所需倍數(shù)，滴加抗原，旋轉(zhuǎn)時間、速度和觀察結(jié)果同定性試驗。

1.2.2TPPA——確證試驗TPPA是將超聲裂解的TP作為抗原致敏明膠顆粒，一旦與梅毒抗體或免疫血清相遇，在適宜條件下產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)(陽性反應(yīng))。TPPA能檢測血清或血漿中抗TP的特異性抗體。在待檢血清中分別加入未致敏粒子(空白對照)、致敏細胞，將反應(yīng)板置震蕩器震蕩30 s；置有蓋濕盒，15～25 ℃避光避震孵育2 h(或放4 ℃冰箱過夜)后觀察結(jié)果。粒子光滑覆蓋整個孔底，邊緣有折疊或周圍有一明顯細胞環(huán)為陽性；粒子緊密沉積孔底中央為陰性。當(dāng)空白對照為陰性時，實驗結(jié)果可靠。

1.2.3TP-IgMELISA——檢測特異性IgM抗體用抗人IgM(抗人μ鏈)包被固相板，借以捕獲血清中的IgM(包括特異性和非特異性的IgM)。實驗前將固相板和標本置于室溫(21～25 ℃)30 min；在相應(yīng)微孔中加入待檢測血清和各質(zhì)控品，室溫孵育20 min，洗板5次；加入酶結(jié)合物，室溫孵育20 min，洗板5次；加入TMB底物液，室溫孵育10 min；加入終止液，15 min內(nèi)用酶標儀讀出A450。根據(jù)要求計算設(shè)定閥值〔cut-off值=A校正液×校正系數(shù)(0.5)〕，用樣品A值和cut-off值計算出每個樣本的抗體值。陽性：標本A值≥cut-off值；陰性：標本A值

1.2.4HIV快速免疫色譜法(AbbottJapan產(chǎn)品) 采用吸附有顯色標記的HIV重組抗原濾紙條，快速檢測標本中的HIV抗體。吸取待檢測血清或血漿于樣品窗，靜置，比對標準色塊，讀取結(jié)果。

1.2.5TP暗視野顯微鏡檢查對一期梅毒患者(硬下疳)進行TP暗視野顯微鏡檢查(darkfield microscopy，DM)。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

135例梅毒患者中，一期梅毒患者臨床表現(xiàn)為生殖器冠狀溝、龜頭、包皮等部位發(fā)生典型的硬下疳。一般為單發(fā)，少數(shù)多個，直徑1～3 cm，圓形或橢圓形；淺在潰瘍或糜爛紅斑，略隆起高出皮面，基底堅實，表面干凈或僅見少量漿液性分泌物，內(nèi)含TP。二期梅毒患者主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜損害，如斑疹、斑丘疹、丘疹和扁平濕疣等。早期潛伏梅毒患者均曾有不潔性交，2年內(nèi)未經(jīng)治療或經(jīng)不正規(guī)治療后，癥狀和體征消退，就診時無任何臨床表現(xiàn)。

所有梅毒患者的治療均采用芐星青霉素G 240萬u，分兩側(cè)臀部肌注，每周1次，共3次。經(jīng)治療后梅毒患者臨床癥狀和體征消失，按要求進行血清學(xué)檢查。

2.2 實驗室檢查

治療前各期梅毒患者實驗室檢查如下。24例一期梅毒患者：TP暗視野檢查均陽性，敏感度100.0%；RPR試驗20例陽性，4例陰性，敏感度83.3%；TPPA和TP-IgM ELISA 22例陽性，2例陰性，敏感度91.7%。93例二期梅毒患者：RPR試驗、TPPA和TP-IgM ELISA全部陽性，敏感度均為100.0%。18例早期潛伏梅毒患者：RPR試驗和TP-IgM ELISA均16例陽性，2例陰性，敏感度88.9%；TPPA 18例陽性，敏感度100.0%(表1)。

131例梅毒患者經(jīng)正規(guī)治療后并隨訪成功。

表1135例梅毒患者治療前梅毒血清試驗結(jié)果

Tab.1Resultsoftreponemalserologictestfrom135casesbeforetreatment

Stage of syphilis nBefore treatment (positive)DM(%) RPR(%) TPPA(%) TP-IgMELISA(%) Primary 24 24(100.0) 20(83.3) 22(91.7) 22(91.7)Secondary 93 93(100.0) 93(100.0) 93(100.0)Early latent 18 16(88.9) 18(100.0) 16(88.9)

RPR試驗檢測20例一期梅毒患，3個月后陽性率90.0%，6個月后陽性率70.0%，9個月后陽性率20.0%，12個月后陰轉(zhuǎn)率100%。TP-IgM ELISA檢測22例一期梅毒患者，3個月后陽性率72.7%，6個月后陽性率45.5%，9個月后陽性率9.1%，12個月后全部陰性，陰轉(zhuǎn)率100%。RPR試驗和TP-IgM ELISA檢測93例二期梅毒患者，3、6個月后均陽性，9個月后陽性率分別為79.6%、82.8%，12個月后陽性率分別為35.5%、32.3%。RPR試驗和TP-IgM ELISA檢測16例早期潛伏梅毒患者，3、6、9個月后陽性率均為100%，12個月后陽性率均為56.3%。131例梅毒患者治療后血清變化與時間的關(guān)系見表2。

表2131例梅毒患者治療后血清變化與時間的關(guān)系

Tab.2Relationshipbetweenchangesinserologicalresultsandtimefrom131casesaftertreatment

Stage of syphilisnRPR (month)3(%) 6(%) 9(%) 12(%)nTP-IgM ELISA (month)3(%) 6(%) 9(%) 12(%)Primary 20 18(90.0) 14(70.0) 4(20.0) 0 22 16(72.7) 10(45.5) 2(9.1) 0Secondary 93 93(100.0) 93(100.0) 74(79.6) 33(35.5) 93 93(100.0) 93(100.0) 77(82.8) 30(32.3)Early latent 16 16(100.0) 16(100.0) 16(100.0) 9(56.3) 16 16(100.0) 16(100.0) 16(100.0) 9(56.3)

3 討論

梅毒的診斷必須根據(jù)病史、臨床癥狀和體征、實驗室檢查綜合分析，其中血清學(xué)檢查對梅毒的確診有十分重要意義。

TPPA[1,2]是梅毒特異性實驗室檢查，主要檢測抗TP IgM/IgG抗體，是梅毒確證試驗。人體被梅毒感染后，體內(nèi)即可產(chǎn)生抗TP抗體，且終身保持。本研究發(fā)現(xiàn)，TPPA對治療前二期梅毒患者檢出率為100%，而且對早期潛伏者，盡管尚無任何體征，但檢出率已達100%，顯示其相當(dāng)高的靈敏度。因此，TPPA可作為梅毒常規(guī)診斷的最佳方法。但其對一期梅毒的檢出率只有91.7%，而暗視野顯微鏡檢查的檢出率是100%，因此血清學(xué)實驗配合暗視野顯微鏡檢查梅毒硬下疳患者是十分必要的。

RPR試驗[1]是梅毒非特異性實驗室檢查，主要檢測抗心磷脂IgM/IgG抗體，常用于梅毒的篩查和療效觀察。本研究用RPR試驗篩查，一期梅毒患者陽性率83.3%，早期潛伏梅毒患者陽性率88.9%，二期梅毒患者陽性率100%。盡管不能達到完全確診，但由于RPR試驗方法簡單、快速、敏感度和特異度較好、價格便宜，可適用于大量人群的篩查，仍是梅毒初篩的好方法。早期梅毒治療后，RPR試驗的血清滴度可下降轉(zhuǎn)為陰性，也可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。

TP-IgM ELISA為梅毒特異性試驗，檢測患者的抗TP IgM抗體。IgM抗體是梅毒感染時最早產(chǎn)生的抗體，并隨治療而逐漸下降或消失，因此理論上認為檢測TP-IgM抗體對早期梅毒、梅毒的再感染、晚期梅毒的診斷及療效判斷有作用。本研究對135例梅毒患者治療前血清進行TP-IgM ELASA，早期潛伏、一期和二期梅毒的敏感度分別為88.9%、91.7%和100%，與McMillan等[3]報道的69%、90%和100%基本一致。另外，其對治療前早期潛伏及一期梅毒的檢出率與RPR試驗的88.9%和83.3%相似，正規(guī)治療12個月后與RPR試驗對梅毒患者的檢出率也相似，并沒有發(fā)現(xiàn)其特別高的靈敏度，而且因TP-IgM ELISA試劑價格昂貴，不適用于臨床常規(guī)檢測。本實驗結(jié)果表明，在臨床診斷中，RPR試驗可部分代替 TP-IgM ELISA。

梅毒患者經(jīng)正規(guī)治療后臨床癥狀和體征消失，應(yīng)定期隨訪。McMillan等[4]對229例早期梅毒患者正規(guī)治療12個月后的血清進行性病研究實驗室試驗(venereal disease research laboratory test，VDRL試驗)和Mercia?IgM酶免疫分析法觀察，陰轉(zhuǎn)率分別為70%和92%。目前，國內(nèi)對正規(guī)治療12個月后的梅毒患者進行RPR試驗和TP-IgM ELISA分析血清變化未見報道。本研究對梅毒患者正規(guī)治療12個月后的血清試驗陰轉(zhuǎn)率進行觀察，結(jié)果顯示RPR試驗檢出陰轉(zhuǎn)率67.4%(87/129)，TP-IgM ELISA檢出陰轉(zhuǎn)率70.3%(92/131)，與文獻報道結(jié)果存在差異。按梅毒的病程分析，一期梅毒患者RPR試驗和TP-IgM ELISA檢出陰轉(zhuǎn)率100.0%；二期梅毒RPR試驗檢出陰轉(zhuǎn)率64.5%，TP-IgM ELISA為67.7%；早期潛伏梅毒患者RPR試驗和TP-IgM ELISA檢出陰轉(zhuǎn)率僅43.7%，也存在較大差異。推測可能與此類患者在治療前1次或多次二期梅毒復(fù)發(fā)有關(guān)，雖經(jīng)正規(guī)抗梅毒治療，但體內(nèi)多克隆免疫記憶B細胞仍發(fā)揮作用。這一現(xiàn)象值得進一步深入研究。

梅毒治療后療效的評估標準為臨床治愈和血清治愈。臨床治愈評估主要是通過正規(guī)治療后控制炎癥，消除損害。血清治愈評估是指梅毒正規(guī)治療后首次RPR試驗效價有4倍下降，并在規(guī)定時間內(nèi)血清抗體陰轉(zhuǎn)。如治療后3個月血清抗體效價沒有2個稀釋度(4倍)下降或2個稀釋度(4倍)上升，應(yīng)予復(fù)治[5]。現(xiàn)尚無文獻報道患者治療與血清陰轉(zhuǎn)所需時間的關(guān)系。有關(guān)梅毒患者治療后血清抗體的變化情況，許多學(xué)者[6,7]開展了感染與免疫學(xué)機制的研究，認為梅毒患者治療后血清抗體變化與T細胞數(shù)量變化和血清固定存在一定關(guān)系，這些結(jié)論用于指導(dǎo)臨床治療和療效評估仍比較困難。龔匡隆等[8]認為梅毒血清試驗的各種方法敏感度存在差異。與TP-IgM ELISA同類的19S IgM-TPPA可用于梅毒的早期診斷，但不能用于治療后二期梅毒的判愈。本研究采用TP-IgM ELISA和RPR試驗對正規(guī)治療12個月后的早期梅毒患者血清抗體進行觀察，僅有一期梅毒患者血清全部陰性，二期梅毒分別有35.5%和32.3%血清陽性，早期潛伏梅毒患者血清陽性率仍達56.3%。在臨床隨訪中，這些梅毒患者并無癥狀和體征表現(xiàn)，HIV試驗陰性，RPR試驗和TP-IgM ELISA仍陽性的因素是否與治療時間、自身免疫功能和隨訪時間相關(guān)，值得今后加強研究。

綜上所述，梅毒血清RPR試驗、TPPA和TP-IgM ELISA這3種方法對未治療梅毒患者的診斷，RPR試驗和TP-IgM ELISA陽性；TPPA也陽性，且對早期潛伏梅毒的敏感性強，較RPR試驗和TP-IgM ELISA診斷率高。對正規(guī)治療后的梅毒患者隨訪，TP-IgM ELASA陰性，RPR試驗基本上也陰性，表明RPR試驗與TP-IgM ELASA結(jié)果一致，可以價廉物美的RPR試驗用作隨訪。因此，TPPA和RPR試驗最適合分別用于梅毒常規(guī)診斷和隨訪。

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