2009流行性感冒患者血清細胞因子的變化特點

毛會軍，陳良，沈芳

上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心，上海 201508

2009年3月墨西哥暴發2009甲型H1N1流行性感冒(簡稱流感)后，全球多個國家相繼出現疫情。2009年6月11日世界衛生組織(World Health Organization，WHO)將流感大流行警告級別提高至6級。我國衛生部也將其納入《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，依照甲類傳染病采取預防、控制措施。本研究檢測了30例確診2009甲型H1N1流感患者治療前的血清細胞因子水平，并通過與健康對照者進行比較，初步探討2009甲型H1N1流感易感人群血清細胞因子的變化及其可能的發病機制，同時檢測經奧司他韋治療后患者血清細胞因子的變化情況。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2009年5月25日～2009年7月13日于上海市公共衛生臨床中心確診的2009甲型H1N1流感患者30例，其中男18例、女12例；年齡10～45歲，平均25歲；均口服抗病毒藥物奧司他韋，75 mg/次，每日2次，療程5 d。為觀察藥物對血清細胞因子的影響，將服藥前所采血樣作為治療前組，服藥后第3天所采血樣作為治療后組。采血時間為上午6∶00～8∶00。

診斷標準參照衛生部頒發的《甲型H1N1流感診斷治療方案(2009試行版第1版)》[1]，排除存在血液病史、免疫系統病史及其他疾病者。同時選擇健康體檢者20例作為對照，其中男8例、女12例；年齡14～43歲，平均27歲。

1.2 標本采集及病原學檢測

采集患者咽拭子標本，送上海市疾病預防控制中心進行病毒核酸檢測。實驗室診斷標準：甲型流感病毒通用M基因陽性，豬H1N1流感病毒通用NP基因陽性，甲型H1N1流感病毒特異HA基因陽性。

1.3 血清細胞因子檢測方法及原理

患者均于入院后第1天、經奧司他韋治療第3天采血，3 500g離心10 min，分離血清，-20 ℃保存待檢。使用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)檢測白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、IL-2、IL-8、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)水平。原理為雙抗體夾心ELISA，在450 nm處讀取A值，濃度與A450值成正比。所有實驗嚴格按照試劑盒操作步驟操作，酶標儀為Thermo公司的MK3型。為避免實驗結果受曲線擬合的影響，直接采用A值。

1.4 統計學方法

治療前、后組與對照組比較，均采用獨立樣本t檢驗；治療前、后組比較，采用配對t檢驗。

2 結果

30例患者口服奧司他韋治療后均恢復良好。

2.1 患者血清中IL-10變化

治療前組血清IL-10平均A值為0.386±0.717，治療后組平均A值為0.323±0.688，而對照組平均A值僅為0.040±0.010。與對照組比較，治療前、后組血清IL-10水平均顯著增高(P<0.05)。而治療前、后組血清IL-10水平無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表12009甲型H1N1流感患者治療前后血清IL-10、IL-2和IFN-γ水平與健康者比較(A450值)

Tab.1IL-10,IL-2andIFN-γserumlevelsinhealthyindividualsandinfluenzavirusA/H1N1/2009-infectedpatientsbeforeandaftertreatment(A450value)

Control group (n=20)Before treatment group (n=30)After treatment group (n=30)IL-100.040±0.0100.386±0.717a0.323±0.688aIL-20.262±0.0150.518±0.685a0.378±0.484 a,bIFN-γ0.041±0.0100.111±0.179a0.074±0.094b

aP<0.05vscontrol group;bP<0.05vsbefore treatment group.

2.2 患者血清中IL-2變化

對照組血清IL-2平均A值為0.262±0.015，治療前組平均A值為0.518±0.685，治療后組平均A值為0.378±0.484。治療前組血清中IL-2水平顯著高于對照組，但經藥物治療后迅速下降。與對照組比較，治療前、后組血清IL-2水平均顯著升高 (P<0.05)，但治療后組血清IL-2水平較治療前組顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.3 患者血清中IFN-γ變化

對照組血清IFN-γ平均A值為0.041±0.010，治療前組平均A值為0.111±0.179，治療后組平均A值為0.074±0.094。與對照組相比，治療前組血清IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)，但治療后組與對照組無統計學差異(P>0.05)。治療后患者血清IFN-γ水平較治療前顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.4 患者血清中IL-8變化。

對照組血清IL-8平均A值為0.130±0.082，治療前組平均A值為1.026±1.112，治療后組平均A值為1.953±1.291。與對照組相比，治療前、后組血清IL-8水平顯著升高(P<0.01)。治療后患者血清IL-8水平較治療前顯著升高(P<0.01)(表2、圖1)。

表22009甲型H1N1流感患者治療前后血清IL-8水平與健康者比較(A450值)

Tab.2IL-8serumlevelsinhealthyindividualsandinfluenzavirusA/H1N1/2009-infectedpatientsbeforeandaftertreatment(A450value)

Control group (n=20)Before treatment group (n=30)After treatment group (n=30)IL-80.130±0.0821.026±1.112a 1.953±1.291a,b

aP<0.01vscontrol group;bP<0.01vsbefore treatment group.

CG, control group; BTG, before treatment group; ATG, after treatment group.

圖12009甲型H1N1流感患者治療前后血清IL-8水平與健康者比較(A450值)

Fig.1ComparisonofIL-8serumlevelsinhealthyindividualsandinfluenzavirusA/H1N1/2009-infectedpatientsbeforeandaftertreatment(A450value)

3 討論

1918年甲型流感病毒大流行，導致近千萬人死亡。至今人類仍舊無法有效控制流感病毒，可能與病毒本身突變有關，也可能與其能在人與動物間傳播并發生重組，且無法消除動物儲存源有關。2009年3月墨西哥暴發的2009甲型H1N1流感是由變異的新型甲型H1N1流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。2009甲型H1N1流感病毒屬正黏病毒科甲型流感病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，基因組約為1 316 kb, 由大小不等的8個獨立片段組成[2]。2009甲型H1N1流感屬于新發疾病，我們前期研究結果提示，2009甲型H1N1流感患者外周血T細胞亞群CD3+T細胞﹑CD4+T細胞和CD8+T細胞均較對照組顯著降低[3]。

流感病毒侵入機體后，刺激機體產生一定的免疫反應，從而對機體的細胞因子分泌產生一定影響。在本研究中，30例2009甲型H1N1流感患者治療前、后的血清細胞因子水平與對照組比較：治療前血清IL-10、IL-2、IL-8和IFN-γ水平均顯著升高。經奧司他韋治療后3 d，患者血清IL-10、IL-2、IL-8水平仍較對照組顯著升高；而IFN-γ水平變化不顯著。治療前、后組比較：IL-10水平變化不顯著，IL-2和IFN-γ治療后顯著降低，IL-8治療后卻顯著升高。結果提示，2009甲型H1N1流感患者血清細胞因子水平異常。本結果與某些國外研究報道相似，如Nakajima等對因2009甲型H1N1流感死亡患者尸檢發現，其血清與肺組織中IL-10、IL-6、IL-2受體(IL-2 receptor, IL-2R)、IFN-α、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和IFN-γ誘導的單核因子(monokine induced by interferon γ，MIG)水平均升高[4]。de Jong等研究發現，H5N1流感重癥患者和死亡病例與高細胞因子血癥存在一定關聯[5]。印度學者研究發現，2009甲型H1N1流感患者疾病嚴重程度與其血漿中IL-1R拮抗劑(IL-1 receptor antagonist，IL1RA)、IL-2、IL-6、巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α/CCL3)、巨噬細胞炎性蛋白-1β(macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β/CCL4)和 IL-10升高呈正相關[6]。Kawashima等報道的2例2009甲型H1N1流感患者重癥病例，一例肺炎合并縱隔氣腫和嚴重低氧血癥，另一例肺炎合并腦病，兩者早期肺分泌物中均有高水平的IL-8、MCP-1 和MIP-1β。住院5 d后，其IL-1β 、IL-6、IL-10、IL-17、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、IFN-γ、MCP-1 和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)明顯增加[7]。

IL-8是一種具有趨化活性的細胞因子，能夠誘導中性粒細胞定向遷移[8]，增加炎癥反應。體外研究發現，在2009甲型H1N1流感前期，支氣管上皮細胞NCI-H292表達的IL-6和IL-8在mRNA和蛋白水平升高不明顯，但在感染后期均明顯升高[9]。Hagau等研究發現，血清IL-8水平在2009甲型H1N1流感引起急性呼吸窘迫綜合征患者中顯著升高，輕癥患者升高不明顯，但肥胖患者中IL-8水平升高更明顯[10]。2009甲型H1N1流感住院患者血清IL-8和IL-13水平較對照組和門診患者顯著升高[11]。我們前期研究表明，2009甲型H1N1流感患者白細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞無明顯變化，中性粒細胞和單核細胞明顯偏高[3]。本研究中，2009甲型H1N1流感治療前、后組患者IL-8水平均較對照組顯著升高，且治療后組比治療前組升高更顯著。這一現象提示，在2009甲型H1N1流感患者體內，中性粒細胞顯著升高可能與IL-8水平升高有關，而IL-8可能與奧司他韋抗病毒機制有一定關系。

IFN-γ和IL-8有促進抗病毒免疫作用，同時通過募集中性粒細胞和單核細胞引起呼吸道部位的炎癥反應[12]。IFN-γ和IL-12在豬流感病毒的發病機制中起一定作用，可誘導急性反應蛋白的產生[13]。在北美豬流感病毒感染的豬血清中，IFN-γ水平升高并不明顯[14]。本研究中，2009甲型H1N1流感治療前組IFN-γ水平較對照組顯著升高，這與A/Texas/36/1991 (H1N1)感染患者鼻腔沖洗液中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α均較對照組顯著升高的結果類似[15]。治療后組與對照組比較，IFN-γ水平變化不顯著，但較治療前組顯著降低。此現象與Hagau等報道一致[10]。這些結果表明，IFN-γ可能與2009甲型H1N1流感的致病性有關；也可能與奧司他韋抗病毒機制有關。

IL-2主要由激活的CD4+T細胞產生，CD8+T細胞產生量較少，是T細胞自分泌和旁分泌細胞因子，主要生物學活性是刺激靶細胞增殖，增強靶細胞的輔助或殺傷功能，并可誘導殺傷細胞產生IFN-γ、TNF-α等細胞因子。IL-2是驅動顆粒酶B表達和穿孔素介導細胞裂解過程的必要細胞因子[16]。血清IL-1β、IL-2、IL-4和MCP-1水平在2009甲型H1N1流感合并嚴重肺炎的患兒中比合并輕度肺炎患者顯著升高[17]。本文研究數據顯示，2009甲型H1N1流感治療前、后組患者血清IL-2水平均較對照組顯著升高，而治療后組較治療前組顯著降低。結果表明，IL-2可能參與2009甲型H1N1流感發病機制，同時可能是參與奧司他韋抗病毒機制的細胞因子之一。

IL-10是一種重要的抗炎細胞因子。病毒感染早期，IL-10的產生是機體控制和限制病毒感染所致炎癥的重要機制之一[18]。IL-10 主要抑制IL-12和IFN-γ分泌，從而促進輔助T細胞(helper T cell，Th細胞)2型分化，而且它是B細胞終分化因子。在B細胞對抗流感病毒抗原時，IL-10起關鍵作用，有助于在感染中和感染后產生保護性抗體。McKinstry等在小鼠模型中研究發現，流感時IL-10抑制Th-17免疫反應且與保護機制相關[19]。2009甲型H1N1流感住院患者血清IL-10水平較對照組和門診患者顯著升高[11]。2009甲型H1N1流感合并肺炎患者血清 IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和MCP-1較未合并肺炎者顯著升高[17]。但Kawashima等報道的2例2009甲型H1N1流感患者重癥病例中，肺分泌物中IL-4均在正常水平，而合并腦病患者IL-10在入院5 d后明顯升高[7]。本研究結果表明，2009甲型H1N1流感治療前、后組患者血清IL-10水平均顯著高于對照組，但治療前、后組之間血清IL-10水平變化無顯著差異。IL-10可能也參與2009甲型H1N1流感的發病機制。

本文初步結果顯示，人感染2009甲型H1N1病毒后，外周血清中IL-10、IL-2、IL-8和IFN-γ均顯著升高；治療后由T細胞亞群產生的IL-10、IL-2和IFN-γ均顯著降低或無變化，而單核-巨噬細胞產生的IL-8卻顯著升高，是否與單核-巨噬細胞吞噬病毒有關，值得進一步研究。另外，我們發現2009甲型H1N1流感患者治療前、后血清細胞因子水平個體差異較大，提示在后續研究中，應該適當增加樣本量；選用多種細胞因子檢測方法，如核酸檢測、生物活性檢測等。

本文不足之處是檢測時間點不足，未能作完全動態觀察。如能在治療前，治療后第1天、第3天、第6天采血測定細胞因子水平，就能深入了解人感染2009甲型H1N1流感病毒后外周血清中細胞因子水平的動態變化。

綜上所述，本研究結果推測：IL-10、IL-2、IL-8和IFN-γ可能與2009甲型H1N1流感的發病機制有關；IL-2、IFN-γ和IL-8可能參與奧司他韋的抗2009甲型H1N1流感作用。

[1] 衛生部.甲型H1N1流感診療方案(2009年試行版第1版) [EB/OL]. http: //www1moh1gov1cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohyzs/s3585/200905/40478.htm.

[2] Peris JS, Poon LN, Guam Y. Emergency of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans [J]. J Clin Virol, 2009, 45: 169-173.

[3] 沈芳,金鑫,毛會軍，高瓊，陳戴紅.2009甲型流行性感冒病毒感染者常規免疫學檢測的臨床意義[J].微生物與感染，2009,4(4):198-202.

[4] Nakajima N, Hata S, Sato Y, Tobiume M，Katano H, Kaneko K, Nagata N, Kataoka M, Ainai A, Hasegawa H, Tashiro M, Kuroda M, Odai T, Urasawa N, Ogino T, Hanaoka H, Watanabe M, Sata T. The first autopsy case of pandemic influenza (A/H1N1 pdm) virus infection in Japan: detection of a high copy number of the virus in type Ⅱ alveolar epithelia cells by pathological and virological examination [J]. Jpn J Infect Dis, 2010, 63(1): 67-71.

[5] de Jong MD, Simmous CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM, Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Hado Q, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J. Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia [J]. Nat Med, 2006, 12(10):1203-1207.

[6] Arankalle VA, Lole KS, Arya RP, Tripathy AS, Ramdasi AY, Chadha MS, Sangle SA, Kadam DB. Role of host immune response and viral load in the differential outcome of pandemic H1N1 (2009) influenza virus infection in Indian patients [J]. PLoS One, 2010, 5(10): e13099.

[7] Kawashima H, Go S, Kashiwagi Y, Morishima Y, Miura T, Ushio M, Nishimata S, Takekuma K. Cytokine profiles of suction pulmonary secretions from children infected with pandemic influenza A (H1N1) 2009 [J]. Crit Care, 2010, 14(2): 411.

[8] 王蘭蘭，吳健民,許化溪，劉輝，李雙慶，李金明，胡洪亮，姜儻，唐中，陶志華，康紅，曾常茜.臨床免疫學與檢驗[M].北京：人民衛生出版社，2008,192-193.

[9] Lam WY, Yeung AC, Chu IM, Chan PK. Profiles of cytokine and chemokine gene expression in human pulmonary epithelial cells induced by human and avian influenza viruses [J]. Virol J, 2010, 7:344.

[10] Hagau N, Slavcovici A, Gonganau DN, Oltean S, Dirzu DS, Brezoszki ES, Maxim M, Ciuce C, Mlesnite M, Gavrus RL, Laslo C, Hagau R, Petrescu M, Studnicska DM. Clinical aspects and cytokines response in severe H1N1 influenza A virus infection [J]. Crit Care, 2010, 14(6): R203.

[11] Bermejo-Martin JF, Ortiz de Lejarazu R, Pumarola T, Rello J, Almansa R, Ramírez P, Martin-Loeches I, Varillas D, Gallegos MC, Serón C, Micheloud D, Gomez JM, Tenorio-Abreu A, Ramos MJ, Molina ML, Huidobro S, Sanchez E, Gordón M, Fernández V, del Castillo A, Marcos MA, Villanueva B, López CJ, Rodríguez-Domínguez M, Galan JC, Cantón R, Lietor A, Rojo S, Eiros JM, Hinojosa C, Gonzalez I, Torner N, Banner D, Leon A, Cuesta P, Rowe T, Kelvin DJ. Th1 and Th17 hypercytokinemia as early host response signature in severe pandemic influenza [J]. Crit Care, 2009, 13(6): R201.

[12] GeurtsvanKessel CH, Bergen IM, Muskens F,Boon L, Hooqsteden HC, Osterhaus AD, Rimmelzwaan GF, Lambrecht BN. Both conventional and interferon killer dendritic cells have antigen-presenting capacity during influenza virus infection [J]. PLoS One, 2009，4(9): e7187.

[13] Barbé F, Atanasova K, van Reeth K. Cytokines and acute phase proteins associated with acute swine influenza infection in pigs [J]. Vet J, 2011, 187(1): 48-53.

[14] Wesley RD, Lager KM, Kehrli ME Jr. Infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus stimulates an early gamma interferon response in the serum of pigs [J]. Can J Vet Res, 2006, 70(3): 176-182.

[15] Fritz RS, Hayden FG, Cafee DP, Cass LM, Peng AW, Alvord WG, Strober W, Straus SE. Nasal cytokine and chemokine responses in experimental influenza A virus infection: Results of a placebo-controlled trial of intravenous zanamivir treatment [J]. J Infect Dis, 1999, 180(3): 586-593.

[16] Brown DM, Kamperschroer C, Dilzer AM, Roberts DM, Swain SL. IL-2 and antigen dose differentially regulate perforin- and FasL-mediated cytolytic activity in antigen specific CD4+T cells [J]. Cell Immunol, 2009, 257(1-2): 69-79.

[17] Takano T, Tajiri H, Kashiwagi Y, Kimura S, Kawashima H. Cytokine and chemokine response in children with the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus infection [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011, 30(1):117-120.

[18] Graham MB, Dalton DK, Giltinan D, Braciale VL, Stewart TA, Braciale TJ. Response to influenza infection in mice with a targeted disruption of the interferon-γ gene [J]. J Exp Med, 1993,178(5):1725-1732.

[19] McKinstry KK, Strutt TM, Buck A, Curtis JD, Dibble JP, Huston G, Tighe M, Hamada H, Sell S, Dutton RW, Swain SL. IL-10 deficiency unleashes an influenza-specific Th17 response and enhances survival against high-dose challenge [J]. J Immunol, 2009, 182(12): 7353-7363.