腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型多重反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的建立及初步應(yīng)用

王婷婷，朱汝南,，錢淵,，鄧潔，趙林清，王芳，鄧?yán)?/p>

1. 北京大學(xué)首都兒科研究所教學(xué)醫(yī)院，北京 100020； 2. 首都兒科研究所病毒研究室，北京 100020； 3. 首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院，北京 100020

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的一種兒科常見傳染病，于1957年首次在加拿大發(fā)現(xiàn)暴發(fā)病例而被正式研究報(bào)道[1]。普通型患者臨床一般表現(xiàn)為手掌、足底、臀部皮膚及口腔黏膜的皰疹或皰疹性咽峽炎，癥狀較輕，病程一般在1周左右，預(yù)后良好。但少數(shù)重癥患兒可引起急性弛緩性癱瘓、腦膜炎、腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥及肺水腫、循環(huán)系統(tǒng)障礙，病情危重時(shí)可引起死亡[2]。引起手足口病的病原體屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，如柯薩奇病毒A組的2、4、5、7、9、10和16型，B組的1、2、3、4和5型，埃可病毒及新型腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)，其中以柯薩奇病毒A16型(coxsackievirus A16，CA16)及EV71為最主要的病原型別。EV71感染被廣泛認(rèn)為是引起手足口病重癥及死亡的主要病原。

1974年Schimidt[3]等從美國(guó)加利福尼亞地區(qū)的1例腦炎患兒中首次分離鑒定EV71，隨后，世界上許多國(guó)家相繼報(bào)道了EV71在不同地區(qū)的流行情況。近年來，EV71流行在整個(gè)東南亞地區(qū)呈上升趨勢(shì)[4-5]。我國(guó)于1981年首次報(bào)道了上海手足口病病例，1995年武漢病毒研究所首次從手足口病患者中分離出EV71。2008年，安徽省阜陽地區(qū)發(fā)生了較大規(guī)模的手足口病暴發(fā)，同年5月手足口病正式列為我國(guó)丙類法定傳染病。根據(jù)衛(wèi)生部手足口病監(jiān)測(cè)公布的數(shù)字，2008年全國(guó)共上報(bào)488 955例感染，126例死亡[6]。此后， 2009年全國(guó)共報(bào)告1 155 525例感染，353例死亡[7]。2010年增加至1 774 669例感染，905例死亡[8]。手足口病近年在全國(guó)多個(gè)省、市的流行越發(fā)強(qiáng)勢(shì)，疾病預(yù)防控制形勢(shì)不容樂觀。

本研究室自2007年起開始對(duì)首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院接診的手足口病患兒進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，北京地區(qū)兒童手足口病主要與CA16及EV71感染有關(guān)[9]，兩者常呈交替流行。每年流行優(yōu)勢(shì)株略有差異，2007年主要以CA16型為主(占總檢測(cè)陽性的95.45%)[10]，2008年主要以EV71感染為主(占總檢測(cè)陽性的82.4%)[11]，2009年CA16與EV71感染陽性比為2.37∶1[12]。病原的確定除了應(yīng)用經(jīng)典的臨床標(biāo)本病毒分離方法外，還應(yīng)用套式反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法同時(shí)進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。套式或半套式RT-PCR方法檢測(cè)敏感度高，是目前手足口病病原檢測(cè)的常用方法。然而在實(shí)際操作中，由于其高敏感度，隨著監(jiān)測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)，樣本量增大，PCR污染問題日益嚴(yán)重；且套式RT-PCR操作過程繁復(fù)，1份標(biāo)本至少要進(jìn)行6、7個(gè)不同的反應(yīng)，不適合大量樣本的檢測(cè)，故本研究通過建立一種較簡(jiǎn)便的多重RT-PCR檢測(cè)方法，用于臨床手足口病病原的監(jiān)測(cè)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本采集

2010年3～10月，采集首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院感染消化科門診和急診中臨床診斷或臨床疑似手足口病患兒的咽拭子、鼻咽部吸出物(或氣管插管深部吸出物)或腦脊液標(biāo)本，于4 ℃暫存，12 h內(nèi)送至病毒研究室。

1.2 標(biāo)本處理

咽拭子及鼻咽部吸出物標(biāo)本于2 700g離心5 min(腦脊液標(biāo)本無需離心)，吸取150 μl上清液至1.5 ml Eppendorf管內(nèi)用于RNA提取；吸取600 μl上清液至另一1.5 ml Eppendorf管中用于病毒分離；其余上清液吸取至2 ml Eppendorf管中，-20 ℃暫存，-80 ℃長(zhǎng)期保存。標(biāo)本處理在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，操作過程注意無菌操作。

1.3 病毒分離

取標(biāo)本液0.3 ml接種到培養(yǎng)至長(zhǎng)滿單層的Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，每份標(biāo)本接種2管；37 ℃吸附2 h后，更換為細(xì)胞維持液1 ml，置37 ℃培養(yǎng)；于倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，至細(xì)胞病變達(dá)+++～++++收獲，置-80 ℃保存。對(duì)培養(yǎng)第7天仍未出現(xiàn)CPE的，盲傳2代，每代觀察7 d，CPE仍陰性者認(rèn)為病毒分離結(jié)果陰性。

1.4 標(biāo)本或病毒培養(yǎng)液RNA提取

取標(biāo)本液或毒株150 μl，采用減量TRIzol法提取RNA，具體操作參照使用說明。

1.5 標(biāo)本及毒株cDNA合成(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(InvitrogenTM)，反應(yīng)總體積為40 μl。首先用22 μl DEPC水將提取的RNA充分溶解，加入10 μmol/L隨機(jī)引物(InvitrogenTM)4 μl，dNTP(各10 μmol/L)2 μl，于65 ℃預(yù)反應(yīng)5 min后，加入5×M-MLVBuffer 8 μl，0.1 mol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)4 μl，RNA酶抑制劑(TRANSTM)0.1 μl，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 0.4 μl，混合后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。條件為25 ℃ 4 min，37 ℃60 min，70 ℃ 15 min。

1.6 引物設(shè)計(jì)及多重PCR

從GenBank中下載腸道病毒常見型別5′端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)、CA16及EV71基因VP1區(qū)序列，應(yīng)用DNAStar-Megalign進(jìn)行序列比較分析，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)5′UTR區(qū)的1對(duì)腸道病毒通用引物pan5′UTR，并在VP1區(qū)設(shè)計(jì)CA16和EV71的型特異性引物，引物序列見表1。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1多重RT-PCR反應(yīng)引物序列

Tab.1PrimersusedinthemultiplexRT-PCR

PrimerSequence (5'→ 3')*Amplicon sizeMelting temperature (℃)pan5'UTR-sAGCACTTCTGTTTCCCCGpan5'UTR-asAGTAGTCGGTTCCGCTGCCA16-vp1-sGTGAAYAAYCAAGTGAAYCGCA16-vp1-asGATGRTTCAACACACATCTMGTYEV71-vp1-sTTCCATAGGAGATAGCGTGAEV71-vp1-asGTGCCYTCAAGAGGGAGAT382 bp55.5184 bp52270 bp52.8

s,sense primer; as, anti-sense primer.

*Degenerate primer abbreviations are as follows: Y, T/C; R, A/G; M, A/C.

多重PCR系統(tǒng)包括：2×GoTaq?Green Master Mix(Promega，USA)12.5 μl，引物均稀釋為10 μmol，通用引物pan 5′UTR-s及pan 5′UTR-as各0.05 μl，型特異性引物 CA16-vp1-s、CA16-vp1-as、EV71-vp1-s及EV71-vp1-as各0.5 μl，加無核酸酶水至總體積為22 μl，以3 μl標(biāo)本反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃ 40 s、51.5 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，先進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；然后以94 ℃ 40 s、49.5 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)初先經(jīng)94 ℃ 6 min預(yù)變性，反應(yīng)最后進(jìn)行72 ℃ 7 min終延伸。毒株核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s、51.5 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)初先經(jīng)94 ℃ 5 min預(yù)變性，反應(yīng)最后進(jìn)行72 ℃ 7 min終延伸。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.7 反應(yīng)敏感度及特異度檢測(cè)

將含EV71和CA16目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行5倍稀釋，稀釋濃度為5-4～5-12。每濃度取3 μl作為反應(yīng)模板，按照上述方法進(jìn)行多重RT-PCR的敏感度檢測(cè)。

選取既往臨床標(biāo)本中經(jīng)直接免疫熒光法或PCR法分別鑒定為CA16，EV71，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1型、3型，鼻病毒，輪狀病毒，愛知病毒(aichivirus)陽性的標(biāo)本反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和腺病毒3型、7型，人Boca病毒，巨細(xì)胞病毒陽性標(biāo)本作為多重RT-PCR特異性檢測(cè)模板。

1.8 應(yīng)用多重RT-PCR進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)

選取臨床標(biāo)本中經(jīng)病毒分離陽性的毒株和標(biāo)本，應(yīng)用多重RT-PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 多重RT-PCR的敏感度研究

含腸道病毒5′UTR基因質(zhì)粒的初始濃度為20 μg/ml，pan 5′UTR引物檢測(cè)到的模板最高稀釋度為5-11(即濃度為0.41 pg/ml)；含CA16-vp1基因質(zhì)粒的初始濃度為52 μg/ml，CA16-vp1引物可檢測(cè)到的最高模板稀釋度為5-10(即濃度為5.32 pg/ml)；含EV71-vp1基因質(zhì)粒的初始濃度為31.1 μg/ml，EV71-vp1引物可檢測(cè)到的最高模板稀釋度為5-11(即濃度為0.64 pg/ml)。敏感度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

A: Primer pan 5′UTR. B: Primer CA16-vp1. C: Primer EV71-vp1.

圖1多重RT-PCR的敏感度

Fig.1ThesensitivityofmultiplexRT-PCR

2.2 多重RT-PCR的特異度研究

本研究建立的多重RT-PCR結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：通用引物及CA16-vp1引物擴(kuò)增均陽性者為CA16陽性；通用引物及EV71-vp1引物擴(kuò)增均陽性者為EV71陽性；僅通用引物陽性者判定為小RNA病毒科腸道病毒感染；3對(duì)引物擴(kuò)增均無陽性條帶者判定為陰性。CA16陽性標(biāo)本經(jīng)多重RT-PCR擴(kuò)增后，在400 bp及200 bp附近均有陽性條帶，與設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期的多重RT-PCR CA16檢測(cè)陽性結(jié)果相符(第1孔)；EV71陽性標(biāo)本擴(kuò)增后，在400 bp及300 bp附近均有陽性條帶，與設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期的多重RT-PCR EV71檢測(cè)陽性結(jié)果相符(第2孔)；特異性檢測(cè)中除CA16及EV71外，其他病毒陽性標(biāo)本均無陽性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，顯示本反應(yīng)系統(tǒng)的特異度為100%(圖2)。

Lanes 1-12, PCR products obtained by multiplex RT-PCR from clinical samples previously positive for CA16, EV71, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus type 1 and type 3, adenovirus type 3 and type 7, rhinovirus, rotavirus, aichivirus, cytomegalovirus, and human bocavirus, respectively; M, PCR markerⅠ(TRANSTM); NC, negative control using DEPC H2O as the template.

圖2多重RT-PCR的特異度

Fig.2ThespecificityofmultiplexRT-PCR

2.3 多重RT-PCR檢測(cè)臨床手足口病標(biāo)本

選取2010年3～10月本研究室收集的371例手足口病患兒標(biāo)本381份(包括咽拭子標(biāo)本353份、痰或肺深部吸出物19份、腦脊液9份)，采用多重RT-PCR方法進(jìn)行病毒RNA檢測(cè)。結(jié)果顯示，通用腸道病毒核酸陽性295份，RT-PCR檢測(cè)總陽性率77.4%。其中CA16陽性121份，檢測(cè)陽性率為31.8%(121/381)；EV71陽性135例，檢測(cè)陽性率為35.4%(135/381)；CA16與EV71檢測(cè)陽性率之比為1∶1.1。不同類型標(biāo)本具體檢測(cè)情況見表2。381份標(biāo)本中共有165份病毒分離鑒定陽性，病毒分離陽性率為43.3%。選取病毒分離陽性的標(biāo)本154份，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)本和毒株的多重RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，154份標(biāo)本中，多重RT-PCR共檢測(cè)出80份CA16陽性、69份EV71陽性。而以病毒分離為標(biāo)準(zhǔn)，154份毒株中，共檢測(cè)出84份CA16陽性、70份EV71陽性。多重RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)CA16的準(zhǔn)確率為95.2%，檢測(cè)EV71的準(zhǔn)確率為98.6%，見表3。部分標(biāo)本及毒株多重RT-PCR結(jié)果見圖3。

A: Clinical samples. B: Cell culture supernatant.

Lanes 1-6, S569, S584, S585, S586, S587, and S588, which were positive for EV71, CA16, CA16, CA16, EV71, and EV71, respectively; M, PCR marker I (TRANSTM).

圖3多重RT-PCR檢測(cè)部分標(biāo)本及毒株中CA16和EV71

Fig.3DetectionresultsofCA16andEV71inclinicalsamplesandcellculturesupernatantusingmultiplexRT-PCRassay

表2多重RT-PCR檢測(cè)不同類型標(biāo)本中CA16和EV71

Tab.2DetectionresultsofCA16andEV71indifferentsampletypesbymultiplexRT-PCR

Sample typeNumber of samplesNumber of positive samplesCA16 EV71 Throat swab353121(34.3%)130(36.8%)Nasopharyngeal aspirate1905(26.3%)Cerebrospinal fluid900

表3應(yīng)用多重RT-PCR進(jìn)行標(biāo)本與毒株檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比

Tab.3ComparisonofthedetectionofCA16andEV71fromclinicalsamplesandcellculturesupernatantisolatedfromthesamesamplesusingmultiplexRT-PCR

Number of positive clinical samples Number of positive cell culture supernatantDetection accuracyCA16808495.2%EV71697098.6%Total14915496.8%

3 討論

本研究設(shè)計(jì)時(shí)將CA16及EV71型特異性引物的擴(kuò)增片段位于2種病毒核酸序列的相同位置上，在同一管中反應(yīng)，可形成一定的模板競(jìng)爭(zhēng)，減少非特 異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，5′UTR-s及5′UTR-as的敏感度較高，達(dá)到5-13，故在反應(yīng)體系配制時(shí)，通用引物濃度僅為其余2對(duì)型特異性引物的1/10。這樣的配制方法可防止通用引物過度擴(kuò)增造成dNTP和酶過量消耗，既達(dá)到5′UTR區(qū)目的片段有效擴(kuò)增，又保證CA16及EV71型特異性引物充分?jǐn)U增。多重RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)比單一PCR的反應(yīng)復(fù)雜，在進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，一般選用的退火溫度比引物理論退火溫度低2 ℃左右。受降落PCR(touchdown PCR)原理提示，本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)中采用2個(gè)退火溫度，最初在較高退火溫度先進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的目標(biāo)片段富集，之后在較低溫度進(jìn)行擴(kuò)增，這樣既可提高特異度，又保證擴(kuò)增效率。

在相同條件下，本實(shí)驗(yàn)室以往使用的套式PCR的敏感度可達(dá)5-12，而本實(shí)驗(yàn)方法的敏感度為5-10～5-11。雖有一定差別，但由于套式PCR操作繁復(fù)、工作量大、污染問題較嚴(yán)重，故對(duì)大量標(biāo)本，套式PCR的高敏感度有些“得不償失”。本實(shí)驗(yàn)方法僅需2個(gè)反應(yīng)即可得到陽性結(jié)果，適用于大量標(biāo)本篩查。對(duì)于篩查陰性的標(biāo)本，可適當(dāng)增大模板量，進(jìn)行二次檢測(cè)，提高檢出率，彌補(bǔ)其敏感度較低的缺點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)有5例標(biāo)本經(jīng)病毒分離鑒定為陽性，但標(biāo)本多重RT-PCR檢測(cè)為陰性。其中有3例經(jīng)套式PCR檢測(cè)為陽性(EV71陽性1例、CA16陽性2例)，考慮與實(shí)驗(yàn)敏感度不同且標(biāo)本模板含量過少有關(guān)；另有2例CA16病毒分離陽性的標(biāo)本按本實(shí)驗(yàn)及套式PCR方法經(jīng)多次擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，因其毒株P(guān)CR擴(kuò)增為陽性，認(rèn)為標(biāo)本中可能含有PCR抑制物。Xiao等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，約2.3%的咽拭子標(biāo)本中存在PCR抑制物，一般處理難以去除，導(dǎo)致普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)生假陰性結(jié)果。此時(shí)，病毒分離及血清學(xué)檢測(cè)是病毒感染重要的參考指標(biāo)。

核酸檢測(cè)是目前病毒檢測(cè)的常用方法之一，方便、快捷，普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行，在基層單位及醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室同樣適用。病毒分離技術(shù)要求較高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于一般臨床檢測(cè)。但是核酸檢測(cè)需要待檢標(biāo)本核酸的目標(biāo)片段與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物相符，在不明病原感染或常見病毒發(fā)生顯著變異、產(chǎn)生新的毒株或型別時(shí)，PCR具有一定的局限性。故病毒分離技術(shù)作為病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，仍有著其他技術(shù)不可替代的重要作用，尤其是對(duì)于網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室及各級(jí)疾病預(yù)防控制中心，病毒分離與核酸檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)等技術(shù)相結(jié)合，才能更好達(dá)到病毒檢測(cè)及監(jiān)測(cè)的目的。

隨著近年來EV71的流行，各國(guó)對(duì)EV71檢測(cè)方法的探討也逐漸深入。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，核酸檢測(cè)的敏感度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短，適用于EV71的快速實(shí)驗(yàn)室診斷。血清學(xué)診斷方面，多采用急性期與恢復(fù)期雙份血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)方法，不適用于疾病的早期診斷。重癥EV71患兒多在發(fā)病1～5 d出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，此時(shí)血清中IgM抗體已可檢測(cè)到。Wang等[14]采用捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)EV71感染患者的血清IgM抗體，敏感度和特異度分別達(dá)到97.7 %和93.3%，且多數(shù)抗體陽性血清采集于發(fā)病7 d內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血清IgM抗體采用的是間接免疫熒光法，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短(2 h左右)，在累積一定判讀經(jīng)驗(yàn)后，與核酸檢測(cè)相結(jié)合，在手足口病流行季節(jié)起重要的輔助診斷作用。另外，標(biāo)本的選擇和采集質(zhì)量對(duì)于病毒分離和核酸檢測(cè)至關(guān)重要。對(duì)于腸道病毒，尤其是CA16及EV71，臨床標(biāo)本中以咽拭子的核酸檢出率和病毒分離率最高[15]，這與病毒在疾病初期常在扁桃體處大量復(fù)制有關(guān)。因?yàn)槠洳杉奖悖绕溥m用于手足口病普通型患兒的臨床篩查和疾病監(jiān)測(cè)。皰疹液的檢出率次之，且僅限于有明顯皮膚皰疹的患兒。對(duì)于重癥患兒，如果入院時(shí)已出現(xiàn)抽搐、昏迷或需進(jìn)行呼吸機(jī)輔助通氣，不利于咽拭子采集，且又無皰疹病變，因腸道病毒多在腸道淋巴結(jié)處大量復(fù)制，糞便中有排毒，此時(shí)可留取糞便標(biāo)本或肛拭子進(jìn)行病原檢測(cè)，檢出率及分離率也較高。對(duì)于出現(xiàn)明顯神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患兒，許多臨床醫(yī)師會(huì)選擇腦脊液標(biāo)本檢測(cè)，但因EV71多引起腦實(shí)質(zhì)病變，在腦脊液中含量較低。許多文獻(xiàn)[13,16,17]均反映腦脊液標(biāo)本檢測(cè)的陽性率低，病毒分離困難，這也與本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際工作中遇到的情況相似。故對(duì)于臨床疑似EV71感染患兒，不推薦首選腦脊液標(biāo)本送檢；對(duì)于送檢的腦脊液標(biāo)本，應(yīng)試用敏感度更高的實(shí)時(shí)PCR 方法[18,19]檢測(cè)病毒核酸及多種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)進(jìn)行病毒分離[15,20]，以獲得更好的檢出率。EV71引起的呼吸困難、呼吸衰竭多由神經(jīng)源性肺水腫引起，肺內(nèi)并無病毒感染灶，故痰液及肺深部吸出物等呼吸道標(biāo)本中病毒含量低(特別是肺泡灌洗液)，核酸檢出率及病毒分離率也較低。臨床在選擇標(biāo)本時(shí)，對(duì)呼吸道分泌物標(biāo)本的送檢應(yīng)仔細(xì)斟酌；實(shí)驗(yàn)室在提取呼吸道分泌物標(biāo)本RNA時(shí)，建議加大提取RNA的初始標(biāo)本量；使用QIAamp?Viral RNA Mini Kit等薄膜吸附法，使痰液中的病毒核酸得以富集，以提高檢測(cè)率。對(duì)于重癥患兒，建議選擇2種不同的標(biāo)本同時(shí)送檢，如咽拭子加皰疹液或咽拭子加肛拭子，并及時(shí)留取血清標(biāo)本，既可提高輔助診斷效率，又可給后期的基礎(chǔ)研究提供材料。

多重RT-PCR檢測(cè)成本低廉，適用于較大量樣本的篩查及監(jiān)測(cè)。但本研究通過標(biāo)本與毒株的多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本的多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果條帶不如毒株清晰，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)雜帶及假陰性結(jié)果，需重復(fù)檢測(cè)，這與標(biāo)本中雜質(zhì)較多且病毒含量不穩(wěn)定有關(guān)。規(guī)范的臨床標(biāo)本采集和更高效的病毒核酸提取方法有助于提高多重RT-PCR檢測(cè)陽性率；也可在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究多重One-Step RT-PCR方法，有望將檢測(cè)過程進(jìn)一步縮短、優(yōu)化。

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