上海地區人類免疫缺陷病毒1型感染者原發耐藥基因及亞型分析

劉莉，馬建新,鄭毓芳 ,張仁芳，沈銀忠，李莉，陳軍，王珍燕，孫富艷，盧洪洲，2，3

1．上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心感染科，上海 201508； 2. 復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040； 3． 復旦大學上海醫學院內科學系，上海 200032

從1981年美國報道第1例艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)至今，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)已奪去數千萬人的生命，成為威脅全人類的重大傳染病之一[1]。HIV反轉錄酶缺乏校正功能，導致HIV易產生基因突變[2]。目前全球已發現多種基因亞型和重組體病毒株。隨著對外開放及交流增多，我國已成為世界上HIV亞型流行最多的國家之一。上海作為國際大都市，外來人口多，人口流動性大，HIV/AIDS患者逐年增加。目前上海地區接受抗反轉錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)的患者近900人。雖然ART的廣泛應用大大降低HIV/AIDS患者的發病率和病死率，但也導致感染人群中HIV耐藥毒株的感染率逐漸增加，這些耐藥毒株正向普通人群傳播。據報道，歐美等國家原發耐藥的發生率已達20%以上。HIV耐藥是抗病毒治療失敗的重要原因之一，是目前抗病毒治療面臨的重大難題。在我國也出現有關未接受抗病毒治療的病例中存在耐藥毒株的報道，給臨床治療藥物的選擇帶來巨大挑戰。本研究的目的是了解上海地區未接受抗病毒治療的HIV/AIDS患者中HIV亞型分布及耐藥基因變異情況，為HIV的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

118例未接受過抗HIV治療的HIV/AIDS患者均為上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心門診或住院病例，經上海市疾病預防控制中心實驗室蛋白免疫印跡(Western blot)法確認為HIV-1感染。

1.2 標本采集

2008年10月～2009年10月，采集乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝的HIV/AIDS患者外周血，經離心分離血漿，分裝后-80 ℃凍存。

1.3 T細胞亞群檢測

采用美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀進行CD4+、CD3+及 CD8+細胞計數，結果用Multiset軟件自動分析。

1.4 基因亞型和耐藥位點突變分析

1.4.1血漿HIV-1RNA提取使用法國生物梅里埃公司的全自動核酸提取儀NucliSENS? easyMAG?提取RNA。

1.4.2HIV-1RNA套式反轉錄-聚合酶鏈反應反轉錄合成cDNA，引物為RT-21(5′-CTGTA-TTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3′)，所得cDNA作為套式反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)模板。第1輪反應引物分別為MAW-26 (5′-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3′)和RT-21(5′-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTT-TGATGGG-3′)。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min；10 ℃保存。生成產物為第2輪PCR模板。第2輪反應引物分別為PRO-1 (5′-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3′ )和RT-20 (5′-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3′)。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min；10 ℃保存。反應所需引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.4.3電泳1%西班牙瓊脂糖(biowest agrose)凝膠電泳：每個樣本5 μl，使用250 bp DNA梯度對照(TaKaRa)，電泳條件為100 V、40 min，PCR擴增產物片段約1.3 kb。電泳結果經凝膠成像儀拍照后存檔。

1.4.4PCR擴增產物純化和核苷酸測序PCR擴增產物由上海生物工程技術服務有限公司純化和測序。

1.4.5序列亞型分析使用BioEdit、ClustalX等軟件進行序列校對、整理和比對分析，使用斯坦福REGA HIV亞型分型工具〔REGA HIV-1 Subty-ping Tool (Version 2.0)，http://dbpartners.stanford.edu/RegaSubtyping〕和美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)HIV亞型分析工具(NCBI HIV Subtyping Tool，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)分析亞型。使用MEGA 4.0，以鄰位連接法繪制系統進化樹。用Bootscaning法(SimPlot 3.2軟件)進行序列特征和重組位點分析。選取的參考株為HIV-1 CRF01_AE(90CF11697，GenBank序列號AF197340)、B基因亞型(WEAU160，GenBank序列號U21135)和C基因亞型(BR025，GenBank序列號U52953)。

1.4.6耐藥性分析應用美國斯坦福大學HIV耐藥數據庫(Stanford HIV Drug Resistance Database，http://hivdb.stanford.edu/)進行耐藥性分析。

1.5 統計學處理

應用統計分析軟件SPSS13進行數據分析。

2 結果

2.1 研究對象基本情況

118例HIV/AIDS患者中，男110例(93.2%)，女8例(6.8%)；平均年齡(38.5±12.5)歲。感染途徑主要為性接觸92例(78.0% )，其余分別為輸血感染(3例，2.5%)、靜脈吸毒感染(2例，1.7%)、有償獻血感染(1例，0.8% )和不明原因感染(20例，17.0%)。CD4+細胞直接計數5～610/μl，平均176/μl。

2.2 HIV-1 基因亞型分布

根據pol基因區序列進行HIV-1基因亞型分析，使用斯坦福REGA HIV亞型分型工具、NCBI HIV 亞型分析工具及HIV BLAST(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)綜合分析確定亞型和重組體，結果CRF01_AE重組體57例(48.3%)、B亞型36例(30.6%)、CRF07_BC 15例 (12.7%)、CRF08_BC 7例(5.9%)、C亞型2例(1.7%)。1例綜合以上分析，依然不能確定亞型，但SimPlot軟件分析結果為B/CRF01_AE(圖1)。其中2例(cnsh4015、cnsh4150)斯坦福REGA HIV亞型分析為A1亞型，但NCBI HIV亞型分析及HIV BLAST提示更傾向于CRF01_AE重組體。通過基因進化樹分析，發現CRF01_AE重組體聚集在一起，將其歸為CRF01_AE亞型(圖2)。性傳播現在已成為我國HIV的主要傳播途徑，各種亞型均有，2例輸血及1例獻血患者感染B亞型，1例輸血患者感染CRF07_BC，2例靜脈吸毒患者均感染CRF01_AE重組體。

圖1 SimPlot Bootscaning 分析結果

2.3 基因進化樹分析

應用MEGA 4.0軟件對所有序列構建進化樹，所用參考序列見圖2。118份pol基因序列中，各型均與其標準序列聚集在一起。B/CRF01_AE二重重組體(編號cnsh7003)大部分序列以CRF01_AE為主，從進化樹上可以看出與CRF01_AE組聚集在一起，但位于CRF01_AE組的邊緣。cnsh7003與B亞型組之間距離0.0081，與CRF01_AE組之間距離0.0532。

圖2118例HIV-1陽性感染者pol基因分布情況

Fig.2polgeneof118HIV-1-positivepatients

2.4 HIV-1耐藥相關基因突變

整理后的pol序列提交斯坦福大學HIV耐藥數據庫進行耐藥突變分析，發現耐藥相關突變發生率較高(64/118)。19例出現核苷酸反轉錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor， NRTI)耐藥突變，突變位點分別為M41L(0.8%，1/118)、D67N(0.8%，1/118)、T69I/N/S(4.2%，5/118)、K70L(0.8%，1/118)、L74V(0.8%，1/118)、V75L(2.5%，3/118)、V118I(0.8%，1/118)、M184V(0.8%，1/118)、L210W/F/M/S(3.4%，4/118)和T215F(0.8%，1/118)。37例發生非核苷酸反轉錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)耐藥突變，突變位點分別為V90I(1.7%，2/118)、L100V(0.8%，1/118)、K103R/N(4.2%，5/118)、V106M/P/I/G(8.5%，10/118)、E138G/A(2.5%，3/118)、V179E/D/T(8.5%，10/118)、Y181C(0.8%，1/118)、G190A(0.8%，1/118)、H221Y(0.8%，1/118)、F227L(0.8%，1/118)、K238S(0.8%，1/118)和Y318F(0.8%，1/118)。蛋白酶(protease, PR)區蛋白酶抑制劑(protease inhibitor，PI)主要突變者5例，突變位點分別為M46L(1.7%，2/118)、L33F(0.8%，1/118)、V32L(0.8%，1/118)和I54F(0.8%，1/118)；PI次要突變者18例，突變位點分別為L10I(8.5%，10/118)、A71T(2.5%，3/118)、A71V(2.5%，3/118)、Q58E(0.8%，1/118)和T74S(0.8%，1/118)。118例樣本中，2例同時存在PI次要、NRTI和NNRTI突變位點，3例同時存在PI次要和NNRTI突變位點，1例同時存在PI次要和NNRTI突變位點，7例同時存在NRTI和NNRTI突變位點。118例中，7例出現對HIV-1抗病毒藥物不同程度的耐藥，耐藥發生率為5.9%(7/118)。HIV-1耐藥發生情況及其在不同亞型中的分布見表1。

3 討論

HIV-1的反轉錄酶缺乏校正功能而易發生復制錯誤，因此在復制過程中易產生大量點突變或插入/缺失突變從而發生重組，形成大量亞型內或亞型間重組毒株[3]。目前世界上已發現9種HIV-1基因亞型和16種重組體病毒株，我國是世界上亞型流行最多的國家之一[4]。本研究顯示，上海地區主要流行株是CRF01_AE重組體，其次為B亞型，還有其他一些亞型，與上海地區的其他研究基本相符[5-7]。CRF01_AE和B亞型是上海地區的主要流行株。有報道[8]已出現B/CRF01_AE二重重組體，本研究也發現B/CRF01_AE二重重組體。基因重組能產生大量變異類型，重組后的病毒基因組中含有來自不同親本的基因，可能改變重組毒株的遺傳特性和生物學表型，提高病毒適應能力。有研究表明，HIV重組體毒株是多種毒株混合感染及在復雜的免疫環境中優勢選擇的結果，較單一基因亞型毒株有更強的傳播能力[9]。本研究中單一亞型感染率為32.2%(38/118)，顯著低于重組體毒株(P<0.01)，說明HIV重組體具有更強的傳播能力，因此應加強此類重組體流行的監測。

通過基因進化樹發現，既有源自泰國的B’亞型，也有源自美國的B亞型，CRF01_AE組內也分多個進化簇分別聚集在一起。說明上海地區不僅亞型或重組體傳播較多，而且亞型中存在較多變異，這些變異毒株還存在一定范圍的傳播。

ART是抑制HIV感染者病毒數量、改善生命質量和延長預期壽命的有效手段，病毒耐藥是ART治療失敗的主要原因之一。但HIV感染宿主后，每天以107～108次的速度進行病毒復制；同時由于HIV反轉錄酶缺乏校讀功能，造成復制產物中存在堿基錯配，導致病毒變異，在藥物壓力下很容易出現基因突變。因此，由基因突變產生耐藥導致抗病毒治療失敗的情況屢有發生。在一些國家，對目前世界衛生組織推薦的一線藥物組合耐藥的比率已>10%[10]。隨著“四免一關懷(中國艾滋病免費治療政策)”的開展，我國越來越多的HIV/AIDS患者得到抗病毒治療；但HIV耐藥毒株的發生率逐漸增多，耐藥毒株的傳播也逐漸增加。本研究發現，耐藥相關突變發生率較高，達54.2%(64/118)，且118例患者中7例出現對HIV-1抗病毒藥物不同程度的耐藥，耐藥發生率為5.9%(7/118)，另外12例(10.2%)出現潛在低度耐藥。

本研究還發現2例針對PI類藥物的耐藥突變株、3例潛在耐藥毒株，另外17例樣本存在PI突變。M46L、L33F等突變位點是PR基因功能的主要位點，在對PI耐藥的產生中起重要作用。有研究發現，PI主要突變能降低病毒對PI類藥物的敏感度，而次要突變會增強病毒對周圍環境改變的適應能力，如校正原發突變導致的復制缺陷。但主要和次要突變同時出現時，會加速耐藥的產生[11]，如M46L合并其他變異時會對IDV/r、NFV、FPV/r、LPV/r等多種PI類藥物產生耐藥。福建、浙江等省的研究也發現，在PR區M46L等位點存在M46L變異，但沒有發現耐藥毒株。本研究發現PI主要突變和次要突變同時存在，說明我國雖然PI使用時間不長，但已在未經抗病毒治療的HIV感染者中發現PI耐藥毒株，如果不重視HIV治療的合理規范，將來可能會產生更嚴重的后果。

表1上海地區HIV-1感染者耐藥發生情況及其在不同亞型中的分布

Tab.1Drugresistanceandresistance-associatedmutationsof118HIV-1-positivepatientsinShanghai

SamplecodeSubtypePI resistanceMutationDrugresistanceNRTI resistanceMutationDrugresistanceNNRTI resistanceMutationDrugresistancecnsh2436BD67N, M184V, T215FHR: 3TC FTCIR: ABCAZTD4TDDIV106M, G190A, F227LHR: DLVEFVNVPIR:ETRcnsh2029BM41L, T69N, L74VHR: DDIIR: ABCLR: D4TPL: AZTTDFK103N, Y181C, H221YHR: DLVEFVNVPIR: ETRcnsh4133CRF01_AEV179D, Y318FHR: DLVIR: NVPLR: EFVETRcnsh4003CRF01_AEPI major:M46LIR: NFVPL: ATV/rFPV/rIDV/rLPV/rcnsh5065CRF07_BCPI minor:Q58ELR: TPV/rcnsh2102BL210WLR: AZTD4TPL: ABCDDITDFV90I, K103Rcnsh2070BE138G, V179ELR: DLVEFVETRNVP

HR, high-level resistance; IR, intermediate resistanc; LR, low-level resistance; PL, potential low-level resistance; PI major: protease inhibitor resistance-associated major mutation; PI minor, protease inhibitor resistance-associated minor mutation.

反轉錄酶區的耐藥突變分為NRTI和NNRTI。NRTI相關耐藥突變位點有5類：①胸苷相似體突變(thymidine analog mutation，TAM)，主要位于41、67、70、210、215和219位點。②TAM相關突變(TAM-associated mutation)。當第44、69、75、118位突變與TAM同時存在時將對NRTI產生耐藥。③Q151M突變復合體。④K65R突變。⑤M184V突變。在本研究中，NRTI耐藥突變19例，占16.1%(19/118)。NNRTI主要耐藥位點為第103、106、181、188及190。本研究中NNRTI耐藥突變37例，占31.4%(37/118)。以上研究提示，基本上全部反轉錄酶耐藥突變位點都存在，耐藥突變相關位點的積累會提高病毒對藥物選擇壓力時的適應性和復制水平，有利于耐藥毒株的產生和傳播。另外通過對比發現，NNRTI的耐藥變異位點和頻率比NRTI多，可能NNRTI更易產生耐藥變異。

本研究中HIV-1感染者耐藥性和亞型分析結果顯示，上海地區HIV-1毒株以CRF01_AE重組體為主，且已出現二重重組體和原發高度耐藥毒株。耐藥情況不容樂觀，應對HIV-1耐藥毒株的疫情蔓延提高警惕，加強宣傳教育，并進一步加強對HIV-1基因亞型和耐藥毒株的監測。

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