結核分枝桿菌蛋白 Hsp16.3的基因克隆以及表達＊

田綠波,羅塏煒,陳肖瀟,呂 冰,樊學軍,張 洋,萬康林

結核病是一種由于結核分枝桿菌感染而引起的慢性疾病。在發展中國家,由于多耐藥結核菌株的出現和增多、艾滋病毒感染的傳播以及人口流動性增強等因素的存在,結核病已經成為主要的傳染病之一[1-2]。據世界衛生組織最新的調查報告顯示,全球約有1/3即20億人口患有結核病,每年新增病人約900萬,年死亡人數近300萬,死亡率已經超過了大部分癌癥病人[2]。我國的情況也不容樂觀,結核病人數僅次于印度,每年新增病人約130萬,每年死亡人數約20萬[3]。新型疫苗的開發、快速廉價并且可靠的診斷方法以及更有效的抗結核藥物的研制等再度成為研究的熱點。

Hspl6.3是由結核分枝桿菌(M.tuberculosis,MTB)hsp X基因(Rv2031C、acr)編碼的蛋白,最初被認為是免疫顯性抗原,后來被確認是一個重要的膜抗原,它的表達與MTB的休眠密切相關[4]。我們利用結核分枝桿菌標準株 H37Rv為模板,通過基因工程方法克隆表達了 Hsp16.3抗原,為下一步深入研究該蛋白的生物學、免疫學活性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和載體 結核分枝桿菌 H37Rv基因組DNA、大腸桿菌BL21(DE3)、表達載體pET30a均為本室保存。

1.2 試劑 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、IPTG購自Takara公司。Taq酶、質粒提取試劑盒購自Tiangen公司。His-Tag純化試劑盒購自 GE公司。

1.3 引物設計 根據3個抗原基因的序列設計了上下游引物,限制性內切酶分別為B glⅡ(A GATCT)和HindⅢ(AAGCTT),所有的引物均由上海生工公司合成。序列如下:

1.4 目的基因的擴增與克隆 以結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板擴增。反應條件:94℃10min,94℃lmin,57℃1min,72℃1min,反應 3O個循環,72℃10min。擴增產物經純化試劑盒處理后,經內切酶雙酶切(B glⅡ,HindIII),酶切后擴增產物經切膠回收與同樣方式處理的表達質粒pET30a在 T4 DNA連接酶作用下連接,連接產物轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞,挑選陽性重組子送北京天根公司測序。

1.5 目的蛋白的誘導表達 將測序驗證正確的重組子接種于含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,待37℃振蕩培養至OD600為0.6～0.8,加入β-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mmol/L,繼續在37℃條件下振蕩培養,誘導表達 3～4h收集菌體;

1.6 SDS-PAGE蛋白鑒定 利用上步得到的菌體沉淀,用 2×凝膠加樣緩沖液 50μL懸浮,煮沸5min,取 10μL進行 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PA GE)鑒定。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增與克隆 pET30重組質粒的構建圖,見圖1。將挑選的陽性重組子送天根公司測序,對構建的重組質粒pET30a-Hsp16.3測序后,通過互聯網登陸 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)后,用BLAST將測序結果與結核分枝桿菌 H37Rv菌株上編碼 Hsp16.3蛋白的基因序列進行比對,結果顯示兩者的序列相符率為99.9%,僅在第39位上的堿基 T突變為C;進一步的蛋白比對結果顯示相符率為99%,僅為測序起始氨基酸處的M測得為L,可能是由于堿基突變引起的。

2.2 目的基因表達產物的SDS-PA GE檢測 取重組菌誘導前后的表達產物進行SDS-PAGE,結果發現誘導的重組菌約在22kDa左右一明顯表達蛋白帶與目標大小相吻合,而未誘導菌無此條帶,見圖2。

3 討 論

MTB與宿主之間的相互作用十分復雜[5],目前具體機制并不是很明確。據文獻報道MTB進入機體后通過調節自身的基因表達去適應宿主的免疫反應,以保證MTB在機體內的存活和生長。Yuan等人將編碼 Hsp16.3的質粒導入 H37Rv中,由于Hsp16.3的高效表達影響了重組菌的生長速率,盡管其對數期A650最大值低于對照組 H37Rv,但是維持該峰值達5d之久,且平臺期生長速率降低緩慢,而對照組A650峰值維持時間短,下降快,在5d時僅為最大值的30%[6]。重組的 H37Rv細菌在平板中培養8～10w時只形成很小的克隆,但是這些克隆可以存活10w之久,說明Hsp16.3的有效表達可以大大提高結核分枝桿菌的生存能力[7]。

Hsp16.3能誘導特異性的免疫反應,具有人和鼠的 T淋巴細胞表位,是有效的亞單位疫苗的靶抗原[8]。Hsp16.3的p91-pll0多肽能部分活化結核菌素純蛋白衍生物試驗(PPD)陽性機體的外周血單核細胞和CD4陽性T淋巴細胞,誘導 Thl型細胞免疫應答,分泌干擾素,有效清除感染的MTB[9-10];同時CD8陽性 T淋巴細胞可以識別 Hsp16.3的p21-p29和p120-p128兩個多肽表位,活化的 CD8陽性T淋巴誘導產生γ干擾素和α干擾素,通過表位穿孔素和粒細胞溶解素溶解感染了MTB的巨噬細胞。因此,對 Hsp16.3生物學特征的深入研究可以為結核新型疫苗的研究提供可靠依據[11-12],特別是對隱性感染者可能起到預防作用。現有的結核病疫苗可以有效抑制早期MTB的增殖,但是感染后期MTB又開始在肺部進行性生長,導致組織損傷或者死亡,人類的結核病病例大部分是這種復發性病例[13]。因此,新型結核病疫苗含有的抗原應是MTB在宿主體內長期存在時(休眠期或潛伏期)大量聚集的靶分子[14-15],例如 Hsp16.3,理論上這種抗原誘導的免疫反應可能抑制潛伏狀態的MTB。如果將該抗原作為疫苗的靶抗原應用,可能會對潛伏性感染結核病的發生有一定的預防作用。

Hsp16.3蛋白對結核的疫苗或診斷研究有重要的作用。而對 Hsp16.3蛋白的成功克隆和表達是進一步研究的起點和突破口。本研究利用pET30a作為表達質粒,成功的構建了重組 Hsp 16.3融合蛋白,通過SDS-PAGE證實融合蛋白的分子量約為22kDa,符合 Hsp16.3分子量16.3kDa加上表達載體分子量5.4kDa的總和,蛋白的實際表達值與理論預測值相符。本實驗的成功為進一步研究Hsp16.3的免疫學特性和結核疫苗奠定了基礎。

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