結核分枝桿菌RpfA蛋白的表達、純化與鑒定＊

趙善民,江 鷹,趙 勇,毛峰峰,張彩勤,郭曉雅,白 冰,師長宏

Rpf(resuscitation promoting-factor)蛋白是最早發現的與休眠細菌復蘇相關的促生長因子[1],該蛋白首先在藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中發現[2];進一步研究證實,該因子也可刺激其他種類的高G+C含量的革蘭陽性菌,包括結核分枝桿菌[3]。結核分枝桿菌的 Rv0867c、Rv1009c、Rv1884c、Rv2389c和Rv2450c均能編碼 Rpf樣蛋白,這5種Rpf蛋白均被證實有可能作為結核病防治的靶抗原加以應用[4]。Rv0867c所編碼的RpfA蛋白不僅與細菌的增殖有關,還有可能是宿主免疫系統識別的一個靶抗原[5]。為此,本研究通過PCR方法從結核分枝桿菌 H37Rv中獲得 Rv0867c的基因片段,進而構建pET32a(+)-Rv0867c重組質粒并轉化入大腸桿菌BL21,表達 His-Rv0867c融合蛋白,為結核桿菌疫苗和快速診斷的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 大腸桿菌E.coliBL21由本中心保存,克隆載體pMD18-T質粒購自大連 Takara公司,表達載體pET32a(+)質粒購自 Invintrogen公司。

1.2 試劑 T4DNA連接酶、限制性內切酶B amH I和HindⅢ均購自大連 Takara公司,質粒小量抽提試劑盒購自BBI公司,膠回收試劑盒購自北京鼎國公司,含Ni2+螯合劑的Ni-NTA His純化試劑盒購自Invintrogen公司,HRP-羊抗鼠 IgG購自武漢博士德公司,小鼠Anti-His Tag mAb購自上海生工,抗Rpf domain mAb由西京醫院檢驗科樊愛琳博士饋贈[6],臨床 TB病人血清由第四軍醫大學附屬西京醫院呼吸內科提供。

1.3 目的基因的獲得 根據 GenBank中結核分枝桿菌Rv0867c的全基因序列,長度為1 224 bp。設計引物,其序列為p1:5′-ATGGATCCATGAGTGGACGCCACCGTAAG-3′,p2:5′-TAAAGCTTT CAGCCGTGACGTACGG-3′,分別插入B amH Ⅰ和HindⅢ的酶切位點。PCR總體系為:50μL體系,反應條件:95℃5 min預變性后,95℃1 min,59℃1 min,72℃1 min,30個循環后,72℃再延伸7 min。反應結束后于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結果。

1.4 克隆載體的獲得 用 T4連接酶將 PCR產物與pMD18-T克隆載體連接,轉化E.coliBL21。隨機挑取3個菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養液中。經B amH Ⅰ和HindⅢ雙酶切鑒定后,將篩選出的陽性克隆送北京奧科生物技術有限公司進行測序。

1.5 含目的基因表達載體的構建和鑒定 提取測序正確的重組克隆質粒,經B amHⅠ和HindⅢ雙酶切后,回收目的基因條帶。將Rv0867c片段與同樣酶切的表達載體pET32a(+)連接,轉化E.coliBL21感受態細胞,涂在含氨芐青霉素的LB平板上。37℃溫箱培養過夜,次日從平板上隨機挑選3個透明直徑約1 mm的單個菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養液中,37℃過夜培養活化,提質粒進行酶切鑒定,陽性克隆即為pET32a(+)-Rv0867c。

1.6 目的基因的誘導表達 將重組表達載體的陽性克隆再活化后以1∶100的比例轉接到5 ml含氨芐青霉素的LB培養液中,37℃振蕩培養2～3 h,加入1 mmol/L IPTG誘導4 h,離心回收菌體沉淀,以2×凝膠加樣緩沖液50μL懸浮,煮沸5～10 min,離心后取10μL上清進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,觀察目的蛋白的表達。

1.7 目的蛋白的Western-blot測定 上述表達產物進行10%SDS-PA GE后,100 V恒壓電轉1 h,轉至硝酸纖維素膜上后用麗春紅染色,觀察蛋白電轉是否成功,然后用蒸餾水洗至無色,l0 g/L牛血清白蛋白封閉過夜,TBST清洗3次,分別與小鼠Anti-His Tag單克隆抗體、1∶10稀釋的抗 Rpf domain mAb和1∶10稀釋的 TB病人血清結合1 h,TBST洗滌三遍后,再分別與 HRP-羊抗鼠 IgG抗體結合1 h,TBST搖床震蕩洗滌3次,TBS震蕩洗滌3次,化學發光顯色。

1.8 目的蛋白的可溶性分析及純化 按前述方法誘導融合蛋白的表達并收集菌體,加入去離子水重懸菌體,超聲裂菌,12 000 r/min離心,將上清、沉淀分別制樣,通過SDS-PAGE進行可溶性分析。根據可溶性分析的結果,以相應的方式用鎳離子柱親和層析純化融合蛋白。

2 結 果

2.1 目的基因的擴增、克隆及酶切鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示Rv0867c基因的PCR產物大小在1 224 bp左右,與Rv0867c的基因預期大小相符。重組質粒雙酶切后經瓊脂糖電泳檢測到大小為1 224 bp的片段,證明pET32a(+)-Rv0867c構建成功。測序結果與GenBank數據庫所收錄的Rv0867c基因一致,見圖1。

圖1 Rv0867c基因的酶切鑒定圖1:DNA marker DL2000;2:Rv0867c PCR基因片段;3:BamH Ⅰ與 HindⅢ雙酶切pMD18-T-Rv0867c片段;4:BamH Ⅰ與 HindⅢ雙酶pET32a(+)-Rv0867c片段Fig.1 Identification of recombinant plasmid1:DNA marker DL2000;2:Rv0867c gene fragment;3:pMD18-T-Rv0867c digested byBamH I andHindIII;4:pET32a(+)-Rv0867c digested by BamH I andHindIII

2.2 重組質粒的測序鑒定 將質粒pMD18-TRv0867c樣品送上海生物工程公司測序,雙向測序結果顯示與 GenBank上公布的 RpfA編碼序列完全一致。

2.3 目的蛋白的表達 重組菌誘導前后表達產物的SDS-PAGE顯示,誘導的重組菌在約102 kDa處有一蛋白條帶,同預計的大小相吻合,而未誘導菌無此條帶,見圖2。

圖2 表達產物的SDS-PAGE分析1:蛋白 marker;2:BL21中未誘導的重組質粒pET32a(+)-Rv0867c的表達產物;3-5:BL21中誘導的重組質粒pET32a(+)-Rv0867c的表達產物Fig.2 SDS-PAGEanalysis of expression product1:Protein marker;2:Expression product of pET32a(+)-Rv0867c without induction in BL21;3-5:Expression product of induced pET32a(+)-Rv0867c in BL21

2.4 表達產物的Western-blot鑒定 結果顯示,在相對分子量約為102 kDa處各有一條表達帶,表明表達產物分別可與Anti-His Tag單抗、Rpf結構域單抗和 TB病人血清特異性結合,見圖3。

圖3 表達產物的Western-blot鑒定1,3,5:表達產物與空BL21菌陰性對照;2:表達產物與小鼠Anti-His Tag mAb的結合帶;4:表達產物與抗Rpf domain mAb的結合帶;6:表達產物與 TB病人血清的結合帶Fig.3 The results of Western-blot analysis1,3,5:Negative control of empty BL21;2:Banding of expression product and mouse against Anti-His Tag mAb;4:Banding of expression product and Anti-Rpf domain mAb;6:Banding of expression product and sera of TB patient

2.5 表達蛋白的可溶性檢測及親和層析純化 在重組菌液中加入尿素裂解液,用超聲波細胞粉碎機進行超聲裂解后,離心,分別取上清和沉淀進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,結果顯示表達的融合蛋白主要以不可溶狀態(包涵體)存在,見圖4。從重組菌中制備的包涵體經洗滌后,用8 mol/L尿素變性,經超聲裂解后加樣到Ni-NTA金屬鰲合親和層析柱上,由于質粒pET32a(+)多克隆酶切位點上游插入編碼6個連續組氨酸殘基的序列(6×His Tag),在重組質粒進行誘導表達時,6×His Tag與外源插入片段共同表達,因而融合蛋白帶有6×His Tag,后者可與金屬鎳發生鰲合,從而使目的蛋白在流經柱床時被特異性吸附,再利用咪唑置換,洗脫下特異性結合的蛋白,見圖4。

圖4 表達產物的純化1:蛋白 marker;2:BL21中未誘導的重組質粒pET32a(+)-Rv0867c的表達產物;3:BL21中誘導的重組質粒pET32a(+)-Rv0867c的表達產物;4:pET32a(+)-Rv0867c表達產物裂解后上清;5:pET32a(+)-Rv0867c表達產物裂解后沉淀;6,7:重組質粒pET32a(+)-Rv0867c表達產物的純化蛋白Fig.4 Purification of expression product1:Protein marker;2:Expression product of pET32a(+)-Rv0867c without induction in BL21;3:Expression product of induced pET32a(+)-Rv0867c in BL21;4:Supernatant of induced BL21 that transformed pET32a(+)-Rv0867c;5:Precipitatant of induced BL21 that transformed pET32a(+)-Rv0867c;6,7:Purified protein ofexpression productof pET32a(+)-Rv0867c in BL21

3 討 論

Rpf蛋白與MTB休眠菌的復蘇密切相關[2],該蛋白可通過其具有的肽聚糖水解酶活性發揮功能,促進細菌的生長,同時還可被宿主的免疫系統識別并引起抗 Rpf的免疫反應,從而可能抑制MTB的生長[4-5]。因此,該類蛋白可作為新的靶點來預防和治療結核病。目前對它進行研究的意義不僅僅是闡明微生物的一種生理現象,而更重要的是希望找到預防結核病和快速檢測MTB感染的有效途徑。

MTB的5個Rpf樣蛋白在大小和結構上雖然有所差別,但它們都包含一段由大約70個氨基酸組成的高度保守區域[7]。有學者采用基因剔除的方法分別構建了5種Rpf基因突變的MTB菌株,發現單個Rpf基因的刪除對MTB的生長沒有明顯影響,而5種Rpf基因均刪除或者部分刪除(如A、B、C或者A、C、D)時,MTB的生長受到明顯影響[8-10],提示這5種Rpf樣蛋白在功能上有一定的重疊和互補。因此,這5種Rpf都有必要進行深入研究。研究顯示,RpfA和RpfD被認為是分泌到細胞外的,其余的3種則被認為是附著在細胞表面。在細菌復蘇早期5種Rpf都能分泌,但RpfA和RpfD在此時達到最大分泌量[1,7]。Rv0867c基因保守序列之后有一個富含脯氨酸和丙氨酸的序列,表達受到一種屬于cAMP受體蛋白家族的轉錄因子(Rv3676)的調節[11],其編碼的蛋白RpfA不僅與細菌的增殖有關,還有可能是宿主免疫系統識別的一個靶抗原。因此,我們表達純化了RpfA蛋白,并進行生物學研究,以期為制備結核病新型疫苗和建立結核病快速診斷方法找到理想的靶抗原。

根據MTB全基因組序列設計Rv0867c的特異性引物序列,通過基因擴增酶切鑒定、序列分析、克隆表達,成功構建了pET32a(+)-Rv0867c表達載體。pET32a(+)是一種融合表達質粒,能夠在外源蛋白N端編碼6個組氨酸殘基,并能編碼硫氧還原蛋白(Trx)與外源蛋白融合表達。硫氧還原蛋白的分子量為22 kDa,使重組蛋白分子量變大,不易被細菌內的蛋白酶降解,從而提高表達產物的穩定性;同時,外源蛋白與 Trx之間還具有腸激酶和凝血酶的識別位點,可以方便的切下 Trx使重組蛋白的構象更接近天然構象。經SDS-PA GE電泳證實獲得了結核分枝桿菌Rv0867c基因的表達蛋白,可能是形成了二聚體的包涵體,從而造成了表觀分子量的2倍增加,該蛋白以包涵體的形式存在。由于該融合蛋白含有6個組氨酸殘基,用Anti-His Tag單抗來初步鑒定融合蛋白的表達,同時用抗Rpf結構域單抗和病人血清進一步鑒定 RpfA與Rpf結構域抗體的反應性。

[1]Kana BD,Mizrahi V.Resuscitation-promoting factors as lytic enzymes for bacterial growth and signaling[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2010,58(1):39-50.

[2]Mukamolova GV,Kaprelyants AS,Young DI,et a1.A bacterial cytokine[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(15):8916-8921.

[3]Mukamolova GV,Kaprelyants AS,Kell DB,et al.Adoption of the transiently non-culturable state-a bacterial survival strategy[J].Adv Microb Physiol,2003,47:65-129.

[4]Yeremeev VV,Kondratieva TK,Rubakova EI,et al.Proteins of the Rpf family immune cell reactivity and vaccination efficacy against tuberculosis in mice[J].Infect Immun,2003,71(8):4789-4794.

[5]Davies AP,Dhillon AP,Young M,et al.Resuscitation-promoting factors are expressed inMycobacterium tuberculosis-infected human tissue[J]. Tuberculosis(Edinb),2008,88(5):462-468.

[6]樊愛琳,師長宏,蘇明全,等.抗藤黃微球菌Rpf結構域單克隆抗體的制備與特性鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志,2008,24(5):484-487.

[7]Mukamolova GV,Turapov OA,Young DL,et al.A family of autocrine growth factors inMycobacterium tuberculosis[J].Mol Microbiol,2002,46(3):623-635.

[8]Downing KJ,Mischenko VV,Shleeva MO,et al.Mutants ofMycobacterium tuberculosislacking three of the five rpf-like genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro[J].Infect Immun,2005,73(5):3038-3043.

[9]Russell-Goldman E,Xu J Y,Wang X B,et al.AMycobacterium tuberculosisRpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes[J]. Infection And Immunity,2008,76(9):4269-4281.

[10]Kana B D,Gordhan B G,Downing KJ,et al.The resuscitationpromoting factors ofMycobacterium tuberculosisare required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growthin vitro[J].Molecular Microbiology,2008,67(3):672-684.

[11]Stapleton M,Haq I,Hunt D M,et al.Mycobacterium tuberculosiscAMP receptor protein(Rv3676)differs from theEscherichia coliparadigm in its cAMP binding and DNA binding properties and transcription activation properties[J].J Biol Chem,2010,285(10):7016-7027.