腸道病毒EV71型浙江分離株 HZ08全基因組序列分析＊

謝榮輝,朱函坪,黃瀟瀟,楊章女,徐 芳,姚蘋蘋,朱智勇

腸道病毒EV71型浙江分離株 HZ08全基因組序列分析＊

謝榮輝1,朱函坪1,黃瀟瀟2,楊章女1,徐 芳1,姚蘋蘋1,朱智勇1

目的 了解浙江省流行的腸道病毒71型 HZ08株的基因特征,研究腸道病毒71型的進化及變異狀況。方法設(shè)計特異性引物,RT-PCR擴增HZ08株全基因,PCR產(chǎn)物純化后克隆于 T載體并進行序列測定和基因進化分析。結(jié)果HZ08株的全基因組由7 405個核苷酸組成,編碼2 193個氨基酸。HZ08的5非編碼區(qū)(UTR)、VP1、VP2、VP3、VP4、P2、P3、3非編碼區(qū)(U TR)和全基因組的核苷酸與C4亞型的毒株序列較高,分別為96.2%～99.1%,92.6%～99.1%,92.7%～98.4%,88%～99.2%,93.8%～99.5%,89.4%～99.2%,91.4%～98.8%,87.8%～100%和91.1%～98.9%。HZ08株與其他亞型各區(qū)段的核酸同源性均低于90%。根據(jù)VP1基因和全基因序列進行種系統(tǒng)發(fā)生分析顯示 HZ08株與中國陸和臺灣的病毒進化關(guān)系較近,與國際標準株以及東南亞毒株進化關(guān)系統(tǒng)較遠。其中 HZ08株與國內(nèi)流行株BJ08和Fuyang08的進化關(guān)系最近。HZ08株與C4亞型相關(guān)氨基酸序列一致,VP1的抗原性表位發(fā)生了變異。結(jié)論HZ08病毒分離株為C4亞型,與Fuyang08和BJ08株進化途徑相同,為腸道病毒71型的基因組功能學和疫苗學研究奠定基礎(chǔ)。

腸道病毒71型;全基因組;序列分析

腸道病毒71型(EV 71)自1969年自次分離以來,其感染已在世界范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)與流行[1-2]。EV 71是引起手足口病的主要病原體之一,也可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病[3]。自2008年以來,我國多個地區(qū)出現(xiàn)了EV 71引起的手足口病疫情,導致多名患者的死亡。因此加強對EV 71的分子生物學研究勢在必行,本研究通過長距離 RT-PCR擴增 EV 71全基因,并對全基因序列進行測定和分析,為開展病毒變異、毒力及其疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 腸道病毒71型病毒株由本實驗室自2008年手足口患者分離而來,并在Vero中進行擴增。

1.2試劑 RNA提取試劑盒(Rnasy mini Kit)購自Qiagen公司;PrimeScrip t reverse Transcrip tase,PrimeSTAR HSDNA polymerase,膠回收試劑盒、DNA片段回收試劑盒均購自寶生物工程有限公司;質(zhì)粒載體p GEM-T試劑盒購自Promega公司。

1.3 引物設(shè)計和合成 根據(jù) GenBank中腸道病毒EV-7型的全基因序列設(shè)計一對引物,上游引物EV 71-FF: 5′-TTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACCC-3′,下游引物 :EV 71-FR:5′-GCT A TTCT GGTTA TAACAAA TTTACCCCCAC-3′。引物由上海生工合成。

1.4 RT-PCR擴增基因片斷 按照 Rnasy M ini Kit說明書提取病毒RNA。按照 PrimeScrip t reverse Transcrip tase說明書操作,先以 EV 71-FR為反轉(zhuǎn)錄引錄,在42℃反應(yīng)1h反轉(zhuǎn)錄全長cDNA,然后利用PrimeSTAR HSDNA polymerase進行基因組全長擴增。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性1min;98℃10s,56℃15s,72℃7m in30s,35個循環(huán);72℃10min。反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中進行檢驗。

1.5 全長cDNA的構(gòu)建與鑒定 RT-PCR擴增產(chǎn)物割膠回收后,產(chǎn)物按照 Taq酶說明書加Po lA尾,反應(yīng)體系如下:PCR產(chǎn)物40μL,dN TP 4μL,Taq酶1μL,10×buffer 5μL。72℃反應(yīng) 30min。反應(yīng)產(chǎn)物用DNA片段回收試劑盒進行純化,以 TA克隆方法將EV 71全長基因組連入PGEM-T-Easy載體中,抽提質(zhì)粒用PCR法鑒定是否插入目的片段。

1.6 序列測定和分析 篩選的陽性克隆經(jīng)PCR鑒定,各選2株送上海生工生物工程有限公司測序,用DNAStar和 Clustal X生物軟件對其進行序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR結(jié)果 從Vero細胞培養(yǎng)的腸道病毒EV 71病毒中提取RNA,并以此為模板進行RTPCR,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電游泳檢測,有1條大小為7 400bp左右的電泳帶,與預(yù)期大小相符。

圖1 EV71病毒全基因擴增結(jié)果M:Wide Range DNA Marker(500～12 000),1:PCR產(chǎn)物Fig.1 RT-PCR analysis of the full-length genome of the HZ08 stra in

2.2 病毒全基因組序列測定結(jié)果 經(jīng)過序列測定和分析后,獲得 EV 71病毒 HZ08株的全基因組核苷酸序列,長度為7 405 bp。其中A占27.2%,G占23.75%,U占24.82%,C占24.23%。腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸豐富。其中5非編碼區(qū)含有742個核苷酸,3非編碼區(qū)含有81個核苷酸。開放讀碼框從473位至7 324位,共6 582個核苷酸,編碼2 193個氨基酸。

2.3 病毒基因組核苷酸及氨基酸同源性比較 將HZ08與其他毒株進行同源性分析發(fā)現(xiàn),HZ08株全基因水平上與SHZH 98與 Fuyang08等C4基因亞型的毒株其同源性較高,而與C1,C2,C5等基因亞型毒株、B基因型及A基因型毒株的核苷酸同源性較低,其中 HZ08株與我國的中國大陸安徽阜陽毒株Fuyang08非常接近,整個基因組核苷酸同源性98.9%。同時也通過對VP1,VP2,VP3,VP4,P2及P3各區(qū)段的核苷酸和氨基酸同源性比較發(fā)現(xiàn),HZ08株與C4基因亞型毒株的核苷酸同源性較高,而與C1,C2,C5等基因亞型毒株、B基因型及A基因型毒株的核苷酸同源性較低,表明 HZ08標屬于C4基因亞型毒株(表1)。分析表明:雖然 EV 71基因型別之間核苷酸差異較大,但氨基酸差異較少,表明EV 71之間核苷酸變異屬于沉默變異,不導致氨基酸的變化。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析 根據(jù)VP1核苷酸序列的同源性,將 EV 71劃分為A、B、C3個基因型,B、C基因型又分為B1-B5和C1-C5亞型。本研究按照VP1和全基因核苷酸序列構(gòu)建進化樹。結(jié)果顯示,HZ08株與中國分離株病毒進化關(guān)系較近,其中 HZ08株與Fuayang 08株進化關(guān)系最近,與國際標準株以及東南亞毒株進化關(guān)系較遠。

2.5 VP1區(qū)亞型相關(guān)表位和抗原性表位相關(guān)的氨基酸序列分析 研究表明VP1區(qū)存在6個與病毒亞型相關(guān)的氨基酸序列[4],本研究發(fā)現(xiàn) HZ08與C4亞型的參考毒株序列的氨基酸組合模式相同,均為43位的 K,58位的A,164位的D,184位的 S,240位的 T及249位的V。VP1區(qū)的92-107位氨基酸為EV 71特異性抗原表位,經(jīng)過序列比較發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的 98位存在著高度變異,其中 HZ08、Chongqing1-09-china和Lanzhou01株98位為K,而BJ08、GZ-08-1和 GDFS-3株在 98位則為 E,但該區(qū)域的其他位點則具有高度的特異性。

表1 HZ08株與各株基因亞型參考株的核苷酸序列同源性(%)比較Table 1 Comparison of the nucleotide sequence between the HZ08 and other enterovirus

圖2 HZ08株EV71病毒VP1基因和全基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phyogenetic tree based on the VP1 gene and the full-length genome between HZ08 and other strains

3 討 論

本研究利用長距離RT-PCR方法擴增腸道病毒 EV 71全長 cDNA的片段,為制備腸道病毒EV 71感染性轉(zhuǎn)錄體奠定了基礎(chǔ)。為了保持全長cDNA的忠實性,本研究采用高可信度的 Prime-STAR HSDNA polymerase進行實驗,該酶具有極強的3′→5′Exonuclease活性而顯示出超群的校正功能,具有很高的可信性。同時本研究擴增了EV 71浙江分離株 HZ08的全基因并對病毒核苷酸序列進行測定分析,有助于完善我國 EV 71病毒株的基因信息,為以后開展滅活疫苗、減毒疫苗以及全基因組功能學等研究作奠定了基礎(chǔ)。

按照VP1基因核苷酸序列的同源性,目前將EV 71劃分為 A、B、C3個基因型[5]。A基因型為EV 71的原形病毒,只包含一個單獨的病毒株B rCr;B基因型可進一步分為B1-B5基因亞型,主要包括美國、澳大利亞、哥化比亞、部份新加坡、中國臺灣和馬來西亞的病毒株;C基因可劃分為C1-C5基因亞型,主要包括美國、澳大利亞、中國大陸與臺灣、加拿大、新加坡和馬來西亞的病毒株[6-7]。研究資料顯示,目前在我國大陸地區(qū)流行的 EV 71毒株主要為C4亞型病毒株。本研究結(jié)果表明:HZ08株與A基因及B基因型毒株在VP1的核苷酸差異均在15%以上,而與C基因型病毒株在VP1區(qū)段核苷酸差異均低于12%,其中與C4亞型各病毒株的同源性較高,表明 HZ08屬于C4亞型毒株。從VP1和全基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示,HZ08株與Fuyang08等國內(nèi)分離株的親緣關(guān)系較近,而與國外分離株的親緣關(guān)系較遠,具有明顯的地域性。但也有研究表明,腸道病毒之間的同源重組位點多位于非結(jié)構(gòu)編碼區(qū)[7],如果僅以VP1作為分型依據(jù),則會忽略EV 71其他基因變異的信息,不能真實反映病毒之間在自然界中的變異狀況。進行全基因研究不僅可以了解其他區(qū)段的基因序列情況,也能反應(yīng)不同基因型別的同源性。本研究結(jié)果顯示:C基因型的 HZ08株與A、B基因型毒株在VP1基因的同源性要高于全基因的同源性,表明 EV 71毒株在其他基因區(qū)域存在著高度變異,VP1基因不能完全反映病毒毒株在自然界重組等變異狀況的發(fā)生。

有研究表明:VP1區(qū)的92-107位氨基酸為EV 71的主要抗原表位,而且此區(qū)域高度保守[8]。但本研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)部分分離株在此區(qū)域的98位發(fā)生了變異,由 E突變?yōu)?K,此位點的改變對病毒抗原性和毒力的影響如何有侍于進一步研究。

[1]Schmidt NJ,Lennette EH,Ho HH.An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system[J].J Infect Dis,1974,129(3):304-309.

[2]Bible JM,Pantelidis P,Chan PK,et al.Genetic evolution of enterovirus 71:epidemiological and pathological implications[J].Rev Med Virol,2007,17(6):371-379.

[3]Tan EL,Chow V TK,Kumarasinghe G,et al.Specific detection of enterovirus 7 l directly from clinical specim ens using real—time-RT-PCR hybridization p robe assay[J].Mol Cell Probes,2006,20:l35-140

[4]董曉楠,應(yīng)劍,陳應(yīng)華.1970-2004年全球腸道病毒71型分離株的分子流行病學分析[J].科學通報,2007,52(9):1021-1027.

[5]JBrow n BA,Oberste MS,Alexander JP Jr,et al.Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 7l strains isolated from 1970 to l998[J].J Virol,1999,73(12):9969-9975.

[6]Fun C Y,AbuBakar S.Phylogenetic evidence for inter-typic recombination in the emergence of human enterovirus 7l subgenotypes[J].BMC Microbio,2006,6:74.

[7]Lin KH,Hwang KP,Ke GM,et al.Evolution of EV71 genogroup in Taiwan from 1998 to 2005:an emerging of subgenogroup C4 of EV 71[J].JMed Virol,2006,78(2):254-262.

[8]姚昕,毛群穎,黃維金,等.腸道病毒7 1型北京分離株全基因組序列分析[J].中華流行病學雜志,2009,30(7):729-732.

Com plete genome sequence analysis of the en terovirus 71 HZ08 strain isolated in Zhejiang

X IE Rong-hui1,ZHU Han-ping1,HUANG Xiao-xiao2,YANG Zhang-nü1,XU Fang1,YAO Ping-ping1,ZHU Zhi-yong1

(1.Zhejiang Provincial Center for D isease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China;2.The Six th Peop le’s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310014,China)

To study the comp lete genome sequence of entrovirus 71 HZ08 strain gene isolated in Zhejiang p rovince and exp lo re its evolution.The total RNA was prepared from enterovirus 71 HZ08 strain and the RT-PCR productswere cloned into T vecto r,sequenced and analyzed.The result of sequencing of the nucleotides showed that the complete gene of the HZ08 strain was 7405 bp in full length encoding 2193 amino acids.Data from sequences analysis showed that HZ08 shared 96.2%-99.1%,92.6%-99.1%,92.7%-98.4%,88%-99.2%,93.8%-99.5%,89.4%-99.2%,91.4%-98.8%,87.8%-100%and 91.1%-98.9%in 5U TR,VP1,VP2,VP3,VP4,P2,P3,3U TR and complete genome with C4 subtype,respectively.HZ08 showed low nucleotides identity(<90%)with o ther subtypes.Phylogenetic trees established from alignment of the complete genome and VP1 region indicated that HZ08 shared the near genetic relationship with EV 71 isolated in china.HZ08 and other C4 subtype strains shared the same amino acids in 6 sites in VP1 region,which were associated with EV 71 subtype.There was one mutation in VP1 antigen epitope.The HZ08 strain belonged to the same genogroup with Fuyang08 and Henan08 strains as C4 gene subtypes.

Enterovirus 71;comp lete genome;sequence analysis

R373

A

1002-2694(2011)08-0679-04

＊浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(2010B027)資助

謝榮輝,Email:ghost_rhxie@hotmail.com

1.浙江省疾病預(yù)防控制中心,杭州 310051;2.杭州市第六醫(yī)院,杭州 310014

2011-03-14;

2011-05-16