腸道病毒EV71相關(guān)受體在人二倍體細(xì)胞KMB17表面的構(gòu)成分析

劉馨，廖云

腸道病毒 EV71 主要感染消化道和呼吸道，然后通過血管運(yùn)送至其他器官產(chǎn)生病毒血癥。在病毒與血管平滑肌細(xì)胞的相互作用過程中，可以導(dǎo)致血管壁細(xì)胞的壞死和血管炎。這種炎癥的產(chǎn)生，與病毒上調(diào)或抑制某些基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生的急性免疫反應(yīng)有關(guān)。EV71 上調(diào)血管細(xì)胞間黏附分子VCAM-1 表達(dá)，在小鼠血管平滑肌細(xì)胞中，EV71感染可通過誘導(dǎo)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet derived growth factor receptor，PDGFR）磷酸化，而刺激 VCAM-1 的表達(dá)[1]。另外的研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染人微血管壁細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo) Toll 樣受體 4（Toll like receptor，TLR4）的表達(dá)[2]。

人二倍體細(xì)胞 KMB17 是理想的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)，腸道病毒 EV71 能適應(yīng)于 KMB17 細(xì)胞，并產(chǎn)生裂解性感染。KMB17 細(xì)胞表面 EV71相關(guān)的受體構(gòu)成情況如何？這些受體的構(gòu)成是否與 EV71 病毒能有效適應(yīng)于 KMB17 細(xì)胞有關(guān)？為了回答上述兩個(gè)問題，本文選用了與 EV71 感染相關(guān)的 TLR4 和 PDGFR-αR1 兩種細(xì)胞表面受體作為研究對(duì)象，利用流式細(xì)胞分析（FACS）、實(shí)時(shí)定量 PCR（real-time PCR）等技術(shù)對(duì)這兩種受體在KMB17 細(xì)胞表面的表達(dá)情況以及受體特異的mRNA 片段進(jìn)行了檢測(cè)，分析了不同細(xì)胞代次、不同細(xì)胞周期時(shí)段及病毒感染前后這兩種受體的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑材料 KMB17 細(xì)胞、EV71 病毒株為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保存；單克隆抗體 PDGFR-αR1（FITC 標(biāo)記，sc-32287）、TLR4（PE標(biāo)記，sc-13593）購自美國(guó) Santa Cruz公司。SYBR Premix Ex Taq? II、Prime-script RT-PCR 試劑盒、碘化丙啶（PI）、Trizol 購自大連寶生物工程有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國(guó) Hyclone 生物技術(shù)公司。

1.1.2 儀器 Prism 7500 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀購自于美國(guó) ABI 公司；FACSCanto II 流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD 公司的產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR 引物 使用 NCBI Primer-BLAST 設(shè)計(jì)了 PDGFR-αR1、TLR4 特異基因片段的引物，由上海生工科技有限公司合成，序列分別如下：

PDGFR-αR1 上游：5’ CATGTCTGAAGAAGA GAGCTCCGAT 3’；PDGFR-αR1 下游：5’ AGTTGT GCGACAAGGTATAATGGCA 3’；TLR4 上游：5’ A CTTATCAATGCATGGAGCTGAATT 3’；TLR4 下游：5’ TTCTGTAAACTTGATAGTCCAGAAA 3’。同時(shí)設(shè)立了 β-actin 引物：β-actin-S：CTCTTCCAG CCTTCCTTCCT；β-actin-AS：AGCACTGTGTTGG CGTACAG，片段大小為 116 bp。

1.2.2 KMB17 細(xì)胞周期的檢測(cè) 使用血清饑餓法進(jìn)行細(xì)胞周期的同步化，用0.1% 的 PI 染色后，對(duì)不同細(xì)胞周期時(shí)段的 KMB17 細(xì)胞中的 DNA進(jìn)行染色和流式細(xì)胞分析。具體如下：細(xì)胞傳代后，長(zhǎng)至 30% 左右，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，24 h 后，再加入血清培養(yǎng)。以血清饑餓后，再次加入血清培養(yǎng)的時(shí)間作為 0 點(diǎn)，按 6、12、24、30、48、60、72 h 分別取 KMB17 細(xì)胞進(jìn)行 PI 染色和檢測(cè)。按 106個(gè)/ ml細(xì)胞重懸細(xì)胞，使用 95% 乙醇于 4 ℃ 固定 1 h 后，離心去除乙醇，用 50 μg/ml的 RNaseA 于 37 ℃ 作用 30 min，PBS 清洗后加入 1 ml PI，于 4 ℃ 染色 30 min 后，清洗，用500 μl PBS 重懸后檢測(cè)。

1.2.3 不同周期時(shí)段 KMB17 細(xì)胞表面 EV71 相關(guān)受體檢測(cè) 取不同細(xì)胞周期時(shí)段的等量（106個(gè)）KMB17 細(xì)胞，用上述相關(guān)的抗體直接標(biāo)記后，做流式細(xì)胞分析。

1.2.4 不同代次 KMB17 細(xì)胞表面 EV71 相關(guān)受體檢測(cè) 用如上方法，對(duì)第 23、25、27、28、30、31 和 33 代的 G0/G1 期 KMB17 細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。

1.2.5 EV71 感染前后相關(guān)受體表達(dá)的變化 用EV71 病毒接種第 27 代 KMB17 細(xì)胞，使 m.o.i =1，吸附 0.5 h 后，加入有 5% 血清的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 12 h 后，按上述方法用熒光抗體標(biāo)記，進(jìn)行 FAC 檢測(cè)，與未感染病毒的細(xì)胞進(jìn)行比較。

1.2.6 Real time PCR檢測(cè) 提取不同細(xì)胞周期的KMB17 細(xì)胞的 RNA，用 oligo DT 通用引物合成cDNA，以上述引物進(jìn)行 real-time PCR 反應(yīng)。具體反應(yīng)步驟按相關(guān)的說明書操作。

2 結(jié)果

圖 1 血清饑餓法同步化后不同時(shí)間點(diǎn) KMB17 細(xì)胞的 PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)間段（A：G0/G1 期；B：S 期；C：G2/M期）Figure 1 PI-stain at different time points of KMB17 cells released from serum starvation synchronization. (A: G0/G1 phase; B: S phase; C:G2/M phase)

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第 27 代 KMB17 細(xì)胞在 EV71 感染前后表達(dá) TLR4 和 PDGFR-αR1 的陽性細(xì)胞比率（A：使用PE 標(biāo)記抗 TLR4 抗體，感染前 12 h；B：使用 PE 標(biāo)記抗 TLR4 抗體，感染后 12 h；C：使用 FITC 標(biāo)記抗 PDGFR-αR1抗體，感染前 12 h；D：使用 FITC 標(biāo)記抗 PDGFR-αR1 抗體，感染后 12 h）Figure 2 Anti-PDGFR-αR1-FITC mAb or anti-TLR4-PE mAb marked the 27th passage KMB17 cells detected by FAC before or after EV71 infection (A: PE conjugated anti-TLR4 Ab, 12 hours before infection; B: PE conjugated anti-TLR4 Ab, 12 hours post infection; C: FITC conjugated anti-PDGFR-αR1 Ab, 12 hours before infection; D: FITC conjugated anti-PDGFR-αR1 Ab, 12 hours post infection)

利用流式細(xì)胞儀研究了 KMB17 細(xì)胞的周期，對(duì)不同周期時(shí)段細(xì)胞表面的 TLR4、PDGFR-αR1的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)；利用 real-time PCR 對(duì)不同細(xì)胞周期時(shí)段 TLR4、PDGFR-α 特異的 mRNA片段進(jìn)行了檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀一共做了 18 次檢測(cè)，研究表明，KMB17 細(xì)胞在使用血清饑餓法進(jìn)行 G0/G1 同步化后約 22 h 進(jìn)入 S 期，在 36 h左右進(jìn)入 G2 期，在 48 h 左右完成分裂。PDGFR-αR1、TLR4 平均陽性細(xì)胞的比例分別為 4.47% 和11.82%；不同細(xì)胞周期時(shí)段、細(xì)胞的不同代次對(duì)2 種受體陽性細(xì)胞的比例影響不大；EV71 病毒感染后，PDGFR-αR1 及 TLR4 陽性的細(xì)胞比率無明顯變化。

2.1 KMB17 的細(xì)胞周期

KMB17 細(xì)胞在使用血清饑餓法進(jìn)行 G0/G1同步化后，約 22 h 進(jìn)入 S 期，約 36 h 進(jìn)入 G2期，在 48 h 左右完成分裂。于是將 KMB17 的細(xì)胞周期初步的劃分為：G0/G1 同步化后，0 ～ 22 h為 G0/G1 期，22 ～ 36 h 為 S 期，36 ～ 54 h 為G2/M 期。在這 3 個(gè)時(shí)段，分別取 6、24、48 h 三個(gè)點(diǎn)作為檢測(cè)點(diǎn)（圖 1）。

2.2 不同周期時(shí)段 KMB17 細(xì)胞表面 EV71 相關(guān)受體的表達(dá)

在 G0/G1 期，通過 FACS 檢測(cè)，PDGFR-αR1、TLR4 的平均陽性細(xì)胞比例分別為 4%、8.9%；在S 期，分別為 2.6%、9%；在 G2/M 期，分別為4.4%、13.5%。

2.3 不同代次 KMB17 細(xì)胞表面 EV71 相關(guān)受體檢測(cè)

使用了第 23、24、25、27、28、30、31 和33 代的 KMB17 細(xì)胞。不同代次細(xì)胞表達(dá) 2 種受體的陽性細(xì)胞率差別不大。

2.4 EV71 感染前后相關(guān)受體表達(dá)的變化

EV71 感染后處于 G0/G1 期的第 27 代KMB17 細(xì)胞（感染前記為 27b，感染后記為 27a），PDGFR-αR1 的陽性細(xì)胞比率有所上升，由 2.6%上升至 4.0%；TLR4 陽性細(xì)胞比率分別為 11.8%和 12.6%（圖 2）。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)不同細(xì)胞周期時(shí)段各受體mRNA 的表達(dá)

使用 RT-PCR 檢測(cè)了 KMB17 細(xì)胞中 TLR4和 PDGFR-αR1 目的片段cDNA（圖 3，核酸電泳圖）。利用 real-time PCR 檢測(cè)了不同細(xì)胞周期時(shí)段，這 2 種受體 mRNA 的相對(duì)表達(dá)情況，在總RNA 保持恒定的情況下，PDGFR-αR1 與 TLR4的相對(duì)表達(dá)量（圖 4，圖 5）。

圖 3 RT-PCR 檢測(cè)人二倍體細(xì)胞中 TLR4 及 PDGFR-αR1 cDNA 片段Figure 3 cDNA fragments detection of TLR4 and PDGFR-αR1 in human diploid cell KMB17 by RT-PCR

圖 4 Real-time PCR 檢測(cè)不同細(xì)胞周期 KMB17 細(xì)胞中PDGFR-αR1（A）和 TLR4（B）cDNA 片段的相對(duì)量Figure 4 Relative quantity of PDGFR-αR1 (A) and TLR4 (B)cDNA fragmentS in KMB17 cells of different cell cycle phases detected by real-time PCR

3 討論

根據(jù) GENECARDS（http://www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫資料，人肺組織表達(dá) PDGFR、TLR4、integrins 等受體，其中 PDGFR、TLR4 與腸道病毒 EV71 的感染相關(guān)。疫苗生產(chǎn)用 KMB17 細(xì)胞是來自于人胚肺的二倍體細(xì)胞，不同的病毒對(duì)KMB17 細(xì)胞的適應(yīng)能力存在差異，而腸道病毒EV71 能夠有效地在 KMB17 細(xì)胞上產(chǎn)生裂解性增殖，可能與細(xì)胞表面表達(dá)相應(yīng)的受體有關(guān)。本文的研究表明 KMB17 細(xì)胞表面表達(dá) PDGFR-αR1、TLR4 這兩種受體；在 KMB17 細(xì)胞的生產(chǎn)許可代次（23 ～ 33 代）之內(nèi)，表達(dá)兩種受體的細(xì)胞陽性率差異不明顯；PDGFR-αR1 在 G0/G1 期表達(dá)較高，TLR4 在 G2/M 期表達(dá)較高。EV71 感染后，表達(dá) PDGFR-αR1、TLR4 的陽性細(xì)胞率有所上升，但差異不大。文獻(xiàn)[2]報(bào)道 EV71 感染后誘導(dǎo)TLR4 在人微血管壁細(xì)胞表達(dá)，但在 KMB17 細(xì)胞中沒有觀察到明顯的 TLR4 表達(dá)的變化，這可能與這兩者細(xì)胞類型的不同有關(guān)。

同時(shí)我們檢測(cè)了 G0/G1 期人二倍體細(xì)系WI38 表面的 TLR4 和 PDGFR-αR1 的表達(dá)情況，分別為 15.7% 和 1.7%，人二倍體細(xì)胞系 IMR90表面的 TLR4 和 PDGFR-αR1 的表達(dá)情況，分別為 4.6% 和 7.4%，存在一定的差異，但兩種受體在不同的人二倍體細(xì)胞中相對(duì)量多寡一致。

圖 5 Real-time PCR 循環(huán)圖Figure 5 Real-time PCR cycle

根據(jù)報(bào)道，A1、A2 型腺苷受體（A1 adenosine，A2 adenosine）的拮抗劑在人肌肉瘤細(xì)胞上有抗EV71 復(fù)制子增殖的作用[3]。我們使用 RT-PCR 沒有在 KMB17 細(xì)胞中檢測(cè)到 A1 Adenosine，A2 Adenosine 的特異的 mRNA 片段。

對(duì) EV71 敏感的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（rhabdomyosarcoma cells）感染 EV71 后的mRNA 差異顯示分析表明，與細(xì)胞膜相關(guān)，又顯著變化的基因有 4 種膜蛋白：膜蛋白 RDEV064 180 BC002392，膜蛋白 palmitoylated 1（55 kD），Leukophysin（LKP）和神經(jīng)元膜表面糖蛋白 M6b[4]。此外，EV71 還可通過DC-SIGN 的介導(dǎo)作用進(jìn)入DC 細(xì)胞[5]。通過克隆表達(dá)法，對(duì)人 T 細(xì)胞 cDNA文庫的篩選發(fā)現(xiàn)，CD126（human P-selectin glycoprotein ligand-1）是 EV71 病毒的功能性受體，但是這個(gè)受體是白細(xì)胞依賴性的，而且是病毒株型特異的[6]，在其他非白細(xì)胞中，EV71 不依賴于 CD126 也能進(jìn)行復(fù)制[7]。

最近的研究認(rèn)為人清道夫受體家族 scavenger receptor B2（SCARB2 CD36 like 2）是 EV71 的一個(gè)細(xì)胞受體[8-9]。與 PDGFR-αR1 和 TLR4 相比，不同的是 SCARB2 與 EV71 最初的感染識(shí)別關(guān)系更為密切，而 PDGFR-αR1 與 TLR4 只是在病毒感染后誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)過程中相關(guān)，因此，正如本研究顯示，在體外病毒的感染和繁殖過程中，由EV71 引起的這兩種受體蛋白的變化也相對(duì)有限。對(duì)疫苗生產(chǎn)用人二倍體細(xì)胞 KMB17 而言，檢測(cè)與病毒識(shí)別密切相關(guān)的受體蛋白的構(gòu)成，如新近發(fā)現(xiàn)的 SCARB2，將更有助于闡明在生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)際過程中該細(xì)胞對(duì)不同的病毒的敏感性存在差異的問題。

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