樹脂聯用富集與純化柴胡總皂苷*

王帥，孟憲生，包永睿，郭小瑞

(遼寧中醫藥大學藥學院，大連 116600)

北柴胡(Bupleurum chinense Dc.)為傘形科柴胡屬植物，是藥用柴胡的主要來源之一。其性微寒，味苦，具有和表解里、疏肝、升陽舉陷的功效，為中醫治療少陽證的首選藥物［1］。其所含主要有效成分為柴胡皂苷，具有保肝利膽、抗炎、鎮痛、抗潰瘍、抗菌、抗病毒、抗細菌內毒素等作用［2-3］。采用大孔吸附樹脂等技術對柴胡總皂苷類成分進行富集純化已有文獻報道，但均采用單一樹脂，且洗脫率不高。筆者采用樹脂聯用技術純化柴胡總皂苷，既可實現較高的洗脫率，又可保證較高的純度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(配有DAD、自動進樣器)，Chem Station(Agilent科技有限公司)，UV-1800紫外分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)，CP225D型電子天平(德國Saritorius集團)。

1.2 試藥 柴胡皂苷A、D對照品(四川維克奇生物科技有限公司，批號:090312，090114)，柴胡藥材(遼寧本溪三藥有限公司提供，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為 Bupleurum chinense DC.)，大孔吸附與離子交換樹脂 HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9、D900(滄州寶恩化工有限公司)，其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相:乙腈(A)-水(B);洗脫梯度(0～26 min:A 30%→42%;～40 min:A 42%);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;檢測波長:210 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷A 2.63 mg，柴胡皂苷 D 2.26 mg，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密量取柴胡皂苷A、D混合對照品溶液6，10，14，18，22，26，30 μL，按上述色譜條件進樣測定，以峰面積的自然對數為縱坐標，柴胡皂苷A(D)量的自然對數為橫坐標，繪制標準曲線，柴胡皂苷A 的回歸方程分別為:Y=93.624X －37.177，r=0.999 6;柴胡皂苷 D:Y=68.734X+38.675，r=0.999 1。表明柴胡皂苷A濃度在1.578～7.890 μg、柴胡皂苷D濃度在1.356 ～6.780 μg范圍內線性關系良好。

2.2 紫外分光光度法

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷 A 5.53 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 檢測波長的選擇 精密吸取柴胡皂苷A對照品溶液0.3 mL，置于10 mL具塞試管中，加甲醇至0.8 mL，加0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL，70℃水浴10 min，后加入磷酸4.0 mL，70℃水浴5 min，放冷，于200～800 nm范圍內進行全波長掃描。結果在541 nm處有最大吸收峰，故確定檢測波長為541 nm。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL，置于 10 mL 具塞試管中，加甲醇至0.8 mL，分別精密加入0.1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL，搖勻，于70℃反應10 min，取出，加入磷酸 4.0 mL［4］，70 ℃ 反應 5 min，取出，放冷，于541 nm處測定吸光度(A值)。以A值為縱坐標，柴胡皂苷A的濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為:A=12.425C －0.019 1，r=0.999 7(n=7)。表 明 柴胡 皂 苷 在 0.110 6 ～0.442 4 mg范圍內線性關系良好。

2.3 柴胡總皂苷的富集與純化

2.3.1 供試液的制備 精確稱取柴胡藥材粉末100 g，10 倍量 90% 乙醇(含 2% 氫氧化鉀)［4］回流提取2次，第1次1.5 h，第2次1 h，過濾，濃縮，定容至250 mL量瓶中(0.4 g·mL-1)，稀鹽酸溶液調至中性，備用。另取柴胡藥材粉末100 g，同法提取，定容至1 000 mL量瓶中(0.1 g·mL-1)，稀鹽酸溶液調至中性，備用。

2.3.2 樹脂的預處理 選擇經95%乙醇浸泡過夜的HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9等7種樹脂，濕法上柱，用95%乙醇洗脫，控制流速，待流出液與水1∶5混合不產生渾濁后，用大量純化水洗至無乙醇味，抽濾至干，備用［5］。

D900樹脂，經3% ～5%鹽酸溶液洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性，3% ～5%氫氧化鈉溶液洗至流出液呈堿性，去離子水洗至中性，備用。

2.3.3 靜態吸附與解吸實驗(優選樹脂) 準確稱取樹脂 HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、NKA、NKA-9各5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入0.4 g·mL-1樣品溶液30 mL。每隔10 min振搖20 s，2 h后吸取一定體積上清液［6］，HPLC法測定含量;樹脂抽濾至干，邊抽濾，邊用水100 mL洗滌樹脂，90%乙醇30 mL解吸，1 h后吸取一定體積解吸液，高效液相色譜(HPLC)法測定含量。結果見表1。飽和吸附量=［樣品中皂苷含量－解吸液中皂苷含量］/樹脂質量;洗脫率(%)=洗脫量/飽和吸附量×100%;終得量=(飽和吸附量－洗脫量)×樹脂質量。由表1可知，NKA-9型號樹脂的飽和吸附量與洗脫率均較高，皂苷的終得量最多，對柴胡皂苷的吸附及解吸性能較好，故確定NKA-9樹脂為最佳選擇。

2.3.4 動態吸附與解吸實驗［7］

2.3.4.1 泄露曲線 準確稱取處理好的NKA-9樹脂5 g，濕法裝于樹脂柱上，上樣100 mL(0.1 g·mL-1)，流速為2 BV·h-1，每10 mL接1管，共接9管，HPLC法測定含量。結果見圖1。結果發現，柴胡皂苷A、D均在上樣量為40 mL時出現明顯泄露，故上樣量宜為30 mL，即1 g樹脂的藥材用量為0.6 g。

2.3.4.2 洗脫醇濃度考察 準確稱取處理好的NKA-9樹脂5 g，濕法裝于樹脂柱上，上樣30 mL(0.1 g·mL-1)，過柱液重新吸附一次，流速為 2 BV·h-1，5倍量(50 mL)水沖洗過后，依次用10%，30%，50%，70%，90%乙醇各30 mL洗脫，分別收集各洗脫液，每10 mL收集1份，HPLC法測定各洗脫液的柴胡皂苷A、D含量，繪制洗脫曲線。其中1～3號瓶為10%乙醇洗脫液，4～6號瓶為30%乙醇洗脫液，7～9號瓶為50%乙醇洗脫液，10～12號瓶為70%乙醇洗脫液，13～15號瓶為90%乙醇洗脫液，結果見圖2。由圖2可知，70%乙醇幾乎將全部柴胡皂苷A與D洗脫下來，故確定總皂苷洗脫醇濃度為70%乙醇。

2.3.4.3 洗脫醇用量考察 準確稱取處理好的NKA-9樹脂5 g，濕法裝于樹脂柱上，上樣30 mL(0.1 g·mL-1)，過柱液重新吸附一次，流速為2 BV·h-1，先用8倍量(80 mL)水除雜，再用3倍量(30 mL)30%乙醇除雜，后用9倍量(90 mL)70%乙醇洗脫，收集30%乙醇除雜液(1～3號)及70%乙醇洗脫液(4～12號)，每10 mL收集1份，共12份，HPLC法測定各樣品中柴胡皂苷A、D含量，繪制洗脫醇用量曲線。見圖3。由圖3可知，8倍量70%乙醇幾乎將全部柴胡皂苷A、D洗脫下來。故確定洗脫除雜方案為:8倍量水、3倍量30%乙醇除雜，8倍量70%乙醇洗脫。

2.3.5 離子交換樹脂 經NKA-9大孔吸附樹脂純化后的70%乙醇洗脫液，以2 BV·h-1的流速直接經過與吸附樹脂等量的D900離子交換樹脂脫色除雜，紫外分光光度法測定總皂苷含量，純度達70.3%。

3 討論

由靜態吸附實驗結果可知，大孔吸附樹脂的孔徑大小對柴胡皂苷的吸附量影響較大，而極性對其洗脫率影響較大。不同極性的 HPD300、HPD400、HPD600樹脂，孔徑較小，其飽和吸附量也相對較小;而其他孔徑相對較大的樹脂，其飽和吸附量也相對較大。同為極性的 HPD600、NKA-9樹脂，其洗脫率均較高，與NKA-9具有相似大小孔徑的NKA樹脂，由于其非極性，故洗脫率不如NKA-9。AB-8樹脂飽和吸附量最大，但洗脫率較小;HPD600洗脫率較大，但飽和吸附量并不大。綜合以上兩種影響因素，考慮其最終得量，故確定NKA-9樹脂為最佳選擇。

在對洗脫醇濃度考察時，10%與90%乙醇液中均不含所需成分，柴胡皂苷A在30%乙醇液中含量占5.32%，50%乙醇液中為 70.60%，70%乙醇液中為24.08%。柴胡皂苷 D在 30%乙醇液中含量占4.20%，50%乙醇液中為 44.46%，70%乙醇液中為51.35%。故確定總皂苷洗脫醇濃度為70%的乙醇。

在對洗脫醇用量考察時，3倍量30%乙醇洗脫液中含有柴胡皂苷A 4.26%和柴胡皂苷D 3.73%;6倍量70%乙醇可將94.01%柴胡皂苷A、88.41%柴胡皂苷D洗脫下來，7倍量70%乙醇可將95.18%柴胡皂苷A、93.06%柴胡皂苷D洗脫下來，而8倍量70%乙醇可將95.74%柴胡皂苷A、96.27%柴胡皂苷D洗脫下來。故確定采用8倍量70%乙醇洗脫，洗脫率＞95%。

在醇溶液的情況下直接上柱脫色是D900樹脂的優點，既省略一些不必要的工序，又可減少有效成分的損失。經NKA-9純化后的樣品，再經D900離子交換樹脂脫色后，其純度達70.3%。

［1］肖功勝，楊云，孫維英，等.柴胡有效成分提取工藝的研究［J］.時珍國醫國藥，2008，19(8):1829.

［2］劉永春，叢培臣.柴胡的化學成分及藥理作用研究概況［J］.黑龍江醫藥，2006，19(3):216 －218.

［3］金順姬.柴胡的藥理作用及臨床應用［J］.現代醫藥衛生，2009，25(7):1074 －1075.

［4］王鵬，王玉生，劉斌.不同產地柴胡中總皂苷及柴胡皂苷A 含量測定［J］.中國藥物與臨床，2008，8(3):228.

［5］陳龍浩，鄒江冰，蔣琳蘭.西番蓮葉中總黃酮的大孔樹脂純化工藝研究［J］.醫藥導報，2010，29(1):85 －87.

［6］馬軼，孟憲生，包永睿.大孔吸附樹脂對淫羊藿中總黃酮及淫羊藿苷吸附純化的研究［J］.亞太傳統醫藥，2009，5(9):48－50.

［7］劉雄.大孔吸附樹脂富集純化柴胡總皂苷的研究［J］.分析測試技術與儀器，2007，13(1):22 －24.