組織工程PHBHH多孔材料喉支架的制備與細胞相容性研究△

孫安科 胡平 李萬同 孟慶延 陳偉 唐維維

目前以種子細胞和生物材料為基本要素、以再生和應用預定形態軟骨組織為基本目標的軟骨組織工程研究正深入展開。喉是全身軟骨組織相對集中的部位，生理功能與美學意義依賴支架軟骨的完整性，喉軟骨腔狀支架的特性決定了應用組織工程技術構建過程中繼續探索合適生物材料及其塑形技術的重要性。與簡單的再生片狀軟骨不同，作為喉支架形態軟骨組織工程生物材料，除了應具有良好的生物相容性、適宜的降解性和合理的孔隙結構外，還應具有足夠的機械強度和靈活的塑性要求。本研究在軟骨組織工程研究的基礎上[1，2]，嘗試應用新型生物材料聚羥基丁酸酯與聚羥基己酸酯共聚物[poly(3-hydroxybutyrate-co -3-hydroxyhexanoate，PHBHH)]來探索組織工程生物材料喉支架形態塑形物的制備及其與軟骨細胞的相容性，為組織工程喉軟骨的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑和材料 聚羥基丁酸酯與聚羥基己酸酯共聚物(PHBHH，分子量為60萬，清華大學化學工程系提供)。DMEM/Ham-F12培養基(Gibco,美國)，Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國)，多聚賴氨酸(Mr:18.9萬；Sigma,美國)，胎牛血清(Fatal bovine serum,FBS,浙江四季青生物制品公司)，胰蛋白酶(Sigma,美國)，氯仿(上海化學試劑有限公司)，乙醇(上海化學試劑有限公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)，掃描電鏡(日本日立S550)，CO2培養箱(Queue,美國)。新西蘭白兔乳兔和成兔(沈陽軍區實驗動物中心)。

1.2多孔PHBHH制備及其喉支架形態塑形

1.2.1塑形模具制備 以成年人全喉軟骨形態為塑形參照，按3：1縮小制備出塑鋼模型。以聚四氟乙烯為模具材料，雕刻出相應形態的陰模，模具由一個內芯和兩塊外板組成(圖1)。

1.2.2多孔PHBHH制備與塑形 采用溶劑澆鑄、模壓成形和顆粒濾瀝方法[3]制備具有喉支架形態生物材料塑形物。方法：定量PHBHH絮狀材料置入球形耐熱玻璃容器內，加入一定比例的氯仿溶劑，密封條件下加熱回流，磁性攪拌器充分攪拌，待溶液成均勻的稀糊狀后，迅速倒入盛有氯化鈉鹽粒(篩分為150～200 μm)的廣口瓶內，密封瓶口，室溫下過夜(使材料自然滲入鹽層內)。取材料與鹽的混合物先制備成片狀，然后包裹模具芯部，再左右合攏外模，金屬夾具固定，液體壓縮成形。脫模樣品置通風櫥中至少48小時，使氯仿充分蒸發。然后放入真空抽濾器中抽濾12小時以除去可能殘留的氯仿。將所得樣品置一金屬網內，懸于盛三蒸水的玻璃容器內，磁力攪拌，濾瀝除鹽，三蒸水至少更換三次。除去鹽粒的樣品自然干燥后做孔隙率測定。

1.2.3多孔PHBHH孔隙率測定 采用液體置換法[4]，因為PHBHH類生物材料具有親油性，故以乙醇替代水，使得液體更易滲入材料的內部。測定方法：在一支可封閉的帶刻度的試管中加入一定體積(V1)的乙醇，稱取質量為M的待測試樣加入試管內，密封，8小時后開蓋一次(以釋放氣體)，再次封閉，24小時后乙醇足夠滲入試樣內的所有孔隙，記下此時的體積V2。飽和了乙醇的試樣取出后，此時試管內乙醇的體積記為V3。則材料的密度ρ=M/(V2-V3)，孔隙率e =(V1-V3)/(V2-V3)×100%。

1.2.4材料消毒與表面助粘 喉支架形態材料塑形物應用前以75%酒精浸泡2小時，取出后無菌環境下晾半干，大量PBS漂洗至少3遍，干燥，無菌多聚賴氨酸溶液浸1小時，干燥后備用。

1.3PHBHH材料喉支架與軟骨細胞復合

1.3.1軟骨細胞獲取 每批10只1周齡新西蘭白兔乳兔，雌雄不限，無菌條件下取其肋軟骨和關節軟骨，去凈軟骨膜，0.1 mol/L滅菌磷酸緩沖液(0.1 mol/L PBS，含青、鏈霉素各200 U/ml)沖洗2遍，0.25%胰蛋白酶先消化2 min，PBS沖洗3遍；然后剪切成1～2 mm3左右碎塊，PBS再浸洗一遍；置50 ml小燒杯中，加0.3%Ⅱ型膠原酶，37 ℃攪拌消化，自1小時起，每半小時收集細胞1次，直到全部固體物消失。所獲細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用PBS洗2遍；DMEM/Ham-F12(1:1)混合培養液(含20% FBS)重懸細胞，臺盼藍染色，細胞計數板(細胞計數板)法計數(染色細胞判為失活力細胞，拒染細胞為活力細胞)。以2×105/ml濃度接種于100 ml培養瓶內，48小時換液1次，細胞貼滿壁后傳代。收集第3代培養軟骨細胞，離心后制成細胞懸液備用。

1.3.2細胞與PHBHH材料喉支架復合 調整細胞懸液為5×107個/ml，采用多點播散方法將細胞懸液接種于經培養液預濕后約七成干燥的塑形材料上，12個PHBHH材料喉支架分3批接種，每批4個，接種時每次少量吸取細胞懸液，均勻點播，盡可能使細胞分布密度一致，塑形材料中空的內面以彎頭吸管接種細胞。細胞與材料復合后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱內孵育半小時取出，調整塑形材料的上下放置狀態，將圍繞材料底部的細胞懸液吸出再次自上而下接種，反復2次后，靜止孵育1小時，再加入新鮮培養液，加入量以浸潤復合物2 cm以上為宜。以后每48小時換液1次，倒置顯微鏡下觀察復合物邊緣細胞生長及附著情況。細胞與材料復合物體外共同培養1周，每批取1個用于本研究。

1.4PHBHH材料喉支架與軟骨細胞復合物掃描電鏡觀察 PHBHH材料喉支架-細胞復合物在無菌蒸餾水中刷洗1次后迅速置2.5%戊二醛中固定，然后梯度酒精脫水、真空抽干，鋒利刀片切開支架形態培養物，上、中、下部位取材，粘托，離子淺射噴金鍍膜后掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1多孔PHBHH喉支架形態塑形物外觀 經模壓成形的PHBHH材料喉支架軟骨形態外觀呈中空半面喇叭狀，棱角分明，形態逼真，濾瀝除鹽后整體結構呈多孔海綿狀(圖2)。

2.2多孔PHBHH孔隙率 經溶劑澆鑄、模壓成形和顆粒濾瀝處理獲取的喉支架形態多孔PHBHH材料，飽和乙醇液體置換法測定其孔隙率為92%±2%，孔徑100～150 μm，厚度1.5 mm左右。

2.3負載軟骨細胞的PHBHH材料喉支架體外培養觀察 接種細胞后24小時，倒置顯微鏡下邊緣觀察見細胞附于材料表面，第二次換液時肉眼下即可見材料表面有薄層透明膠凍狀物均勻分布，培養1周膠凍樣物質明顯增多 (圖3) 。

2.4掃描電鏡觀察

2.4.1單純多孔PHBHH材料 呈多孔海綿狀，彼此之間連性好，孔徑約100～150 μm(圖4)。

2.4.2PHBHH材料與細胞復合物 細胞密布材料表面及其海綿狀空隙中，呈單個、串狀或簇狀分布，細胞周圍黏液狀的基質物質相互間有粘連，高倍鏡下可見軟骨細胞表面呈現多個類圓形小突起，可能為軟骨細胞分泌的尚未融合的基質成分(圖5)。

圖1 以聚四氟乙烯為模具材料，雕刻的制備喉形態模具，由一個內芯和兩塊外板組成圖2 制備出的喉支架形態PHBHH生物材料塑形物圖3 負載軟骨細胞的PHHHB材料喉支架體外共同培養一周倒置顯微鏡下觀察(×100)圖4 制備的多孔PHBHH泡沫材料掃描電鏡觀察(×500)圖5 負載軟骨細胞的PHHHB材料掃描電鏡觀察(×1 000)

3 討論

組織工程技術為喉支架形態軟骨修復重建提供了新思路和新方法，但在耳鼻咽喉科領域，軟骨組織工程研究并未呈現出其應有的優勢，究其原因可能在于喉軟骨屬中空不規則結構軟骨框架，框架形態組織工程化軟骨的構建與應用除了對種子細胞質量與數量有較高要求外，對其細胞外基質材料的生物相容性、降解性、孔隙結構、機械強度和塑形條件也有較高要求。 目前可作為軟骨組織工程細胞外基質材料的生物材料主要包括以下四大類：天然生物材料(膠原、纖維蛋白和殼聚糖等)、人工合成生物材料[聚羥基乙酸(polyglycolic acid ，PGA)等]、由微生物合成的新型生物材料[聚羥基烷酸酯類生物材料及其共聚物(polyhydroxy alkanotes,PHAs)和復合材料(聚乳酸-膠原和纖維蛋白-聚氨酯)等][5]。這些生物材料在生物相容性、降解速率控制、內部結構設計、細胞黏附性、代謝微環境、機械強度及塑形靈活性等方面各有其優缺點，天然生物材料缺乏足夠的機械強度，人工合成與復合生物材料普遍存在價格昂貴、加工工藝復雜、不易塑形等問題。雖然目前針對眾多應用于軟骨組織工程的生物材料尚缺乏系統的對照研究與統一標準，也還沒有一種生物材料能完全符合軟骨構建與應用的要求，但對于塑形要求較高的中空框架狀軟骨組織工程研究，新型生物材料PHAs顯示出較好的性能[6]。

PHAs類材料是微生物在碳源過量，而氮源、磷源缺乏時，積累在體內作為營養和能量儲存物質參與細胞代謝的天然物質，由微生物制造獲取的PHAs，不含人工合成生物材料可能殘留的有害物質，是極潔凈的生物材料之一。PHAs具有高熔點、高結晶度、高分子量、耐拉伸和生物相容性良好、無致炎性、無排斥性和易降解等特點,而且與聚羥基乙酸(PGA)和聚羥基丙酸(PLA)相比，PHAs類材料酸性較弱，因此降解產物的酸性反應明顯低于PGA和PLA[6，7]。研究表明，PHAs系列聚合物中，隨著單體碳數的增加，力學性能存在著從脆性到粘性的轉變。由于該系列聚合物種類較多，且聚合物之間有較好的相容性，通過對不同聚合物的優勢組合，可以得到具有更佳強度、韌性、生物相容性和可控降解性的組織工程支架材料。由聚羥基丁酸酯[poly(3-hydroxybutyrate) ，PHB]與聚羥基已酸酯[poly(3-hydroxyhexanoate)，PHH]共聚而成的優化PHAs材料聚羥基丁酸已酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co -3-hydroxyhexanoate)，PHBHH]，不但具有PHAs類材料的優點，而且價格低廉、來源充裕、體內代謝及其生物反應性實驗較充分，是值得關注與進一步研究的軟骨組織工程生物材料之一[8]。

本研究以PHBHH絮狀物為原料，采用溶劑澆鑄、模壓成形方法制備喇叭狀喉支架形態PHBHH材料塑形物，濾瀝除鹽后支架塑形物形態保持良好，具有相當的機械強度。掃描電鏡顯示制備的塑形物材料呈多孔海綿狀，孔徑與篩分氯化鈉鹽粒大小基本相符。經乙醇體積浸潤法測定海綿狀材料孔隙率大于90%，符合組織工程生物材料多孔狀、高孔隙率和具有一定機械強度的基本要求，為組織工程技術構建和應用像喉、氣管這樣中空狀支架組織與器官提供了又一種選擇材料。

為探討多孔海綿狀PHBHH材料能否作為理想的軟骨組織工程種子細胞載體，本實驗通過掃描電鏡觀察了體外培養的細胞-材料復合物中細胞與材料粘附、細胞分布、細胞生長及分泌基質狀況等。結果發現多聚賴氨酸表面助粘的海綿狀多孔PHBHH材料接種軟骨細胞后細胞黏附率高、分布均勻，細胞-材料復合培養一定時間細胞周圍及細胞與細胞間可見豐富的膠凍狀物質，基質分泌旺盛，高倍鏡下細胞表面呈現的多個顆粒狀小體可能為細胞分泌的基質成分，說明細胞在材料表面生長狀況良好。隨著研究的深入，今后以人離體軟骨作為種子細胞來源觀察與PHBHH的相容性將更宜于臨床應用。

本研究表明以溶劑澆鑄、模壓成形和濾瀝除鹽技術制備的喉支架形態組織工程PHBHH泡沫多孔生物材料具有良好的機械強度、孔隙率和細胞相容性，是中空支架形態組織工程化軟骨組織構建與應用可選擇的制備技術與生物材料之一。但其作為一種代替軟骨的中空支架形材料，在受到內、外壓力時，承受多大的壓力而能保持其形態和內腔大小不變需要進一步進行實驗驗證。

迄今軟骨組織工程研究已取得相當大進展[9,10]，但在喉支架形態軟骨構建與應用方面尚未呈現出作為現代醫學新技術的優勢，面臨著諸如血管化、黏膜化、柔韌化、復合化和支撐化腔狀軟骨及其附屬組織共同構建與移植技術方法創立與完善的難題。以組織工程喉支架形態軟骨研究為出發點，首先設想將組織工程軟骨與組織瓣移植技術相結合應用于喉支架軟骨病損的修復重建，有望使組織工程化喉支架形態軟骨早日實現臨床應用。在此基礎上，繼續不懈的探索支架形態組織工程軟骨與黏膜、肌肉、韌帶等復合化組織構建與應用的技術方法將是今后努力的目標。

4 參考文獻

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9 Tani G, Usui N, Kamiyama M, et al. In vitro construction of scaffold-free cylindrical cartilage using cell sheet-based tissue engineering[J]. Pediatr Surg Int,2010,26:179.

10 Kim DY, Pvun J, Choi JW, et al. Tissue-engineered allograft tracheal cartilage using fibrin/hyaluronan composite gel and its in vivo implantation[J]. Laryngoscope,2010,120:30.