密碼子優化提高重組金葡菌腸毒素O在大腸桿菌中的表達水平

黃 鵬，孫紅穎，陳樞青

密碼子優化提高重組金葡菌腸毒素O在大腸桿菌中的表達水平

黃 鵬，孫紅穎，陳樞青

(浙江大學藥學院藥物毒理與生化藥學研究所，浙江杭州310058)

目的：優化稀有密碼子提高重組腸毒素O的表達量。方法：將帶His標簽的腸毒素O成熟肽克隆至pET28a質粒上，采用PCR方法對15個稀有密碼子進行突變，將突變后的重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，并進行蛋白表達及活性鑒定。結果：通過稀有密碼子優化，重組腸毒素O的表達量由菌液總蛋白的7.49%提高至19.8%;小鼠淋巴細胞增殖試驗表明，通過密碼子優化的腸毒素O具有刺激淋巴細胞增殖的作用，并且其增殖作用與未優化前的腸毒素O相當。結論：稀有密碼子優化能夠有效增加腸毒素O的表達量。

葡萄球菌，金黃色/免疫學;腸毒素類/免疫學;密碼子;基因表達;遺傳載體;質粒;突變;細胞增殖;淋巴細胞

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(3):297-303.］

金葡菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)是由金黃色葡萄球菌分泌的一類蛋白質［1］，可以不經抗原提呈細胞(APC)加工處理，以完整分子的形式與Ⅱ型組織相容性抗原(MHC-Ⅱ)和 T細胞受體(TCR)結合成復合物，從而刺激T細胞的活化、增殖，并且大量釋放細胞因子［2］。目前被成功鑒別并分離的主要腸毒素血清型有20多種:TSST-1、TSST-2、SEA ～SEE、SEG ～SEQ［3］及 SEU2 和 SEV［4］等。這些腸毒素都由一系列遺傳元件攜帶，具有高度相似的三維結構和穩定性［5］。腸毒素 O(SEO)屬于新型腸毒素或類腸毒素，其基因由egc攜帶，與同家族成員的氨基酸序列同源性介于23.7% ～43.2%［6］。本實驗室已成功克隆表達了重組金葡菌腸毒素O(rSEO)，并證實其具有超抗原活性［7］，但其表達量和凝血酶酶切活性較低，使得rSEO得率較低。有研究報道［8］，外源基因所含稀有密碼子的豐度影響著大腸桿菌對其的表達，對腸毒素A進行密碼子優化能使其表達量上升至總蛋白的15%～20%［9］。為此，本研究通過 Quick Change點突變法對腸毒素O包含的15個稀有密碼子進行優化，最后經過pET表達系統進行蛋白表達，以及生物學活性鑒定，為今后的腸毒素相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒細胞系 E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)為本實驗室保存;pGEX-4T-1、pET28a和pGEX-4T-1-SEO質粒也為本實驗室保存;ICR小鼠，體重(15±2)g，雄性，購自浙江大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR聚合酶、限制性內切酶XhoI、EcoRI和T4連接酶為Takara產品;Ni2+NTA His-bind resin層析凝膠購于Novagen;親和層析相關的緩沖液Bind Buffer(50 mol/L 磷酸鈉，10 mmol/L 咪唑，pH8.0)、Wash Buffer(50 mol/L磷酸鈉，30 mmol/L咪唑，pH8.0)和 Elute Buffer(50 mol/L磷酸鈉，150 mmol/L 咪唑，pH8.0)自配;脫鹽柱(HiTrap Desalting)、陰離子層析柱(HiTrap Q Sepharose)為GE Healthcare產品;瓊脂糖、瓊脂和IPTG為BBI產品;蛋白胨、酵母提取物為OXIOD產品;胰蛋白酶、刀豆蛋白(ConA)為 Sigma產品;Western blot對照品HSA-PTH、SEC2-His為實驗室制備;rSEO為實驗室制備，切除GST-SEO融合蛋白的GST標簽后獲得;RPMI1640培養基為GIBCO產品;新生牛血清(FCS)為杭州四季青生物工程材料有限公司產品;MTT為Sigma產品;DNA抽提試劑盒、DNA回收試劑盒為Amxygen產品;PCR引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成;DNA測序由上海桑尼基因集團有限公司完成。1.3 實驗方法

1.3.1 SEO基因獲得與表達載體pET28a-SEOHis的構建 以實驗室貯存的PGEX-4T-1-SEO質粒為模板，設計PCR引物:上游gcagaattcat gaatgaagaagatc，下 游 actctcgagttagtggtggtggtggt ggtgtgtaaataaataaacatc;PCR獲得帶有 XhoI和EcoRI酶切位點，以及C端帶有His-tag的重組腸毒素O，標記為 SEO-His。PCR條件為:5×PrimeStar Buffer 10 μl、dNTP(10 mmol/L)4 μl、上下游引物(10 μmol/L)1 μl、質粒模板 0.5 μl、PrimeStar 1U 補充 ddH2O 至 50 μl;98℃ 3 min，98℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s共25 次循環，最后72℃ 10 min。

XhoI、EcoRI雙 酶 切 SEO-His片 段 和pET28a質粒，回收含黏性末端的SEO-His片段和pET28a片段，經T4連接酶連接后篩選陽性克隆。

1.3.2 稀有密碼子分析與優化 通過http://www.doe-mbi.ucla.edu/～ sumchan/c altor.html和Genscript Rare Codon Analysis Tool在線分析軟件分析SEO序列:SEO基因包含編碼精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸的15個豐度較低的稀有密碼子，密碼子適應指數為0.68，平均 GC 含量為26.69%。

通過Quick Change法進行點突變，設計10條突變引物涵蓋以上15個稀有密碼子，其中1條涵蓋3個稀有密碼子的引物，3條涵蓋2個稀有密碼子的引物，6條涵蓋1個稀有密碼子的引物(表1)。以pET28a-SEO-His為原始模板，PCR獲得產物經過DpnI消化后轉化DH5α感受態并通過Kan抗性篩選陽性克隆，以測序正確質粒為模板和對應的引物依次進行剩余的PCR，突變后質粒依次編號為#1～#10。PCR體系條件分別為:5×PrimeStar Buffer 10μl、dNTP(10 mmol/L)4 μl、上下游引物(10 μmol/L)1μl、質粒模板0.5 μl、PrimeStar 1U 補充 ddH2O至50 μl;98℃ 3 min，98℃ 30 s、(50 ±5)℃ 30 s、72℃ 405 s共20次循環，最后72℃ 10 min。

表1 突變引物設計Table 1 The design of PCR primer for mutation

1.3.3 表達宿主的構建與表達條件優化XhoI和EcoRI雙酶切pET28a-SEO-His的10個突變體，得到10個SEO-His片段，并與pET28a質粒重新連接，轉化DH5α感受態擴增質粒。將擴增后的重組質粒轉化，篩選陽性克隆落進行表達，優化表達條件為:1%接種量接種于2×YT培養基，37℃培養至OD值0.5左右，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，20℃誘導20 h。分別取突變株誘導后菌液進行SDS-PAGE分析。

1.3.4 SEO-His的純化與鑒定 菌液離心、誘導，收集菌體 1 L，經 4℃、6 000 r/min 30 min，用30 ml Bind Buffer重懸，French Press 1 000 PSI高壓破菌。8 000 r/min離心1 h，除去細胞碎片，上清經0.22μm微孔濾膜過濾，通過Ni2+NTA His-bind resin進行親和層析，用100 ml Wash Buffer清洗，30 ml Elute Buffer洗脫;洗脫產物經HiTrap Desalting脫去鹽離子后進行陰離子層析(HiTrap Q sepharose)，梯度洗脫除去20 kD左右的雜蛋白;脫鹽后蛋白溶液通過50 kD半透膜去除70 kD左右的雜蛋白。

以SEC2-His為陽性對照，HSA-PTH為陰性對照，與SEO-His同時進行SDS-PAGE;轉膜條件為100 V 2 h。一抗為抗His-tag的小鼠單抗，稀釋比為1∶5 000;二抗為HRP標記山羊抗小鼠IgG，稀釋比為1∶5 000。按以上條件對SEO-His進行Western blot鑒定。

1.3.5 MTT法測定SEO對小鼠淋巴細胞的增殖作用［7，10］以 ConA 為陽性對照，BSA 為陰性對照，測定重組腸毒素O刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖活性。分別取 rSEO、ConA、BSA和SEO-His，適量用 PBS溶解，0.22 μm 濾膜過濾、除菌備用。

設零孔(僅含培養基)、空白孔(脾淋巴細胞)、陰性對照孔(脾淋巴細胞+BSA)、陽性對照孔(脾淋巴細胞+ConA)和實驗孔(脾淋巴細胞+重組腸毒素O)，每組3個復孔。將新鮮制備的ICR小鼠的脾淋巴細胞懸浮于含20%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，計數后將細胞濃度調節至2×106個/ml，每孔100 μl。分別將rSEO、SEO-His用無血清RPMI 1640培養基依次稀釋至 20 μg/ml、2 μg/ml、200 ng/ml和 20 ng/ml，根據實驗設計每孔加入100μl。重組腸毒素加入培養體系中，終質量濃度分別為10 μg/ml、1 μg/ml、100 ng/ml和 10 ng/ml。ConA和BSA經稀釋后終質量濃度亦為10μg/ml、1 μg/ml、100 ng/ml和 10 ng/ml，在 37℃、飽和濕度5%CO2培養箱培養44 h后，每孔加MTT液(5 mg/ml)20μl，吹打混勻，在培養箱中繼續培養4 h。棄培養液，每孔加DMSO 120μl，吹打助溶，37℃孵育10 min，待甲瓚完全溶解。然后，采用酶標儀雙波長法(570 nm為測定波長，630 nm為參考波長)測定各孔OD值，檢測重組腸毒素O對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用。各孔OD值除以陰性對照為淋巴細胞增殖指數(proliferation index)。

1.3.6 統計學處理 實驗數據以均數±標準差表示。多組樣本之間比較采用雙因素方差分析(Two-way analysis of variance，ANOVA)，采用LSD法進行多重比較。所有數據均采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SEO-His基因片段的克隆重組表達載體的構建 以PGEX-4T-1-SEO為模板進行PCR擴增，獲得的目的條帶大小為700 bp左右，符合預期實驗結果。

XhoI/EcoRI雙酶切處理SEO-His基因片段和pET28a質粒，通過膠回收試劑盒回收并純化含有黏性末端的上述片段，T4連接酶連接過夜后轉化DH5α感受態，擴增獲得的質粒經雙酶切驗證。陽性克隆測序結果顯示插入基因與C端帶His-tag的腸毒素O成熟肽完全一致。

2.2 PCR方法進行定點突變 按照 Quick Change點突變法進行稀有密碼子優化，PCR擴增所得大小為6 000左右的目的片段，轉化擴增后獲得的質粒經XhoI/EcoRI雙酶切驗證并測序。

圖1 SEO-His與其突變株的誘導表達Fig.1 Soluble expression of SEO-His and its mutants

2.3 SEO-His的表達與各個突變株的表達比較 按上述條件誘導表達SEO-His，取菌液進行SDS-PAGE分析，顯示在29 kD處有明顯條帶;在相同條件下誘導表達各個突變種，通過菌液SDS-PAGE分析，比較密碼子優化過程中各個點的表達情況(圖1A、B);通過灰度掃描，計算出各個突變種所表達的目的蛋白占菌體總蛋白比。結果顯示，未突變菌株以及突變菌株#1～#10的SEO-His表達水平(占菌體總蛋白百分比，%) 分別為:7.49 ± 0.30、10.4 ± 0.71、14.7 ± 0.68、15.6 ± 0.51、15.6 ± 0.95、16.6 ±0.81、17.2 ±0.74、17.5 ±1.0、17.7 ±1.1、19.7±0.55、19.8 ±0.63。

2.4 SEO-His的純化 將高壓超聲破菌處理后的菌液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液經Ni2+NTA His-bind resin進行親和層析，Elute Buffer洗脫下的溶液進行SDS-PAGE分析(圖2A)。將脫鹽后產物進行陰離子層析除去20 kD雜蛋白，再次脫鹽后通過50 kD半透膜除去70 kD雜蛋白后進行SDS-PAGE分析(圖2B)。電泳結果顯示獲得的SEO-His有較高純度，可進行后續實驗。

2.5 Western blot鑒定 以 His-tag為靶標進行Western blot，SDS-PAGE對照和 PVDF膜顯色結果顯示:陽性(SEC2-His)和樣品(SEOHis)均有明顯條帶，而陰性(HSA-PTH)并沒有產生相應的反應(圖3)。

圖2 Ni2+NTA His-bind resin親和層析(A)及純化后的SEO-His(B)Fig.2 SEO-His purified by Ni2+NTA His-bind resin(A)and purified SEO-His(B)

圖3 SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鑒定SEO-HisFig.3 Verification of SEO-His by SDS-PAGE(A)and Western blot(B)

2.6 MTT法測定重組腸毒素O對小鼠淋巴細胞的增殖作用 利用MTT法對重組腸毒素O與密碼子優化后表達獲得的SEO-His的超抗原活性進行了測試。對結果采用雙因素分析法，顯示與陰性對照相比，在0.01μg/ml～10μg/ml質量濃度范圍內，密碼子優化后的重組腸毒素O具有刺激小鼠淋巴細胞增殖作用(F=58.0、P ＜0.05，圖4)。在 0.01 μg/ml下，與相同質量濃度陰性對照組(0.01μg/ml BSA 1.0±0.06)相比，rSEO、ConA、SEO-His組作用 48 h后，小鼠淋巴細胞增加概率有顯著性的統計學意義(rSEO 組 1.2 ± 0.06，P=0.001;ConA組 1.1 ± 0.02，P=0.027;SEO-His 組 1.3 ±0.06，P ＜ 0.001);其他濃度的 rSEO、SEO-His及ConA作用48 h后，相比相同濃度下的陰性對照組，小鼠淋巴細胞增加概率均有統計學意義(10 μg/ml條件下，BSA 組1.0 ±0.09、ConA組 1.7 ± 0.05、rSEO 組 2.1 ±0.09、SEO-His組2.1 ±0.05，均 P ＜0.001)。而在 0.01、0.1、1、10μg/ml這4個質量濃度下，對rSEO及SEOHis兩組數據進行分析，兩藥物對小鼠淋巴細胞的增殖作用并無統計學意義(P=0.13)。

圖4 MTT法測定重組腸毒素O對小鼠淋巴細胞的增殖作用Fig.4 Stimulation effect of the recombinant staphylococcal enterotoxin O on proliferation of murine lymphocytes by MTT assay

3 討論

目前研究表明，在大腸桿菌中編碼精氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸及脯氨酸的一些稀有密碼子，如 AGG/AGA/ATA/CTA/GGA/GGG/ACG/CCC等對蛋白質表達水平影響較大［11-13］，而對SEO的密碼子分析表明，其核酸序列中包含大部分上述稀有密碼子。本研究通過定點突變技術，用10條引物將其中所含的15個稀有密碼子更換為大腸桿菌偏好的密碼子，從而使蛋白質的表達量由占整個菌體總量的7.49%提高到19.8%，這說明稀有密碼子確實限制了腸毒素O在大腸桿菌中表達，也證明通過密碼子優化來提高腸毒素O的表達水平的策略是成功的。本研究發現，靠近N端的一些稀有密碼子對蛋白表達水平影響較為顯著，對其優化能較大地提高蛋白的表達水平;同時發現，并不是以上所有稀有密碼子，經優化都對蛋白表達水平的提高產生顯著影響，即使是同一種稀有密碼子在不同位置引起的偏倚對蛋白量的表達水平也會有不同程度的影響。例如在19位的ATA→ATT的突變使蛋白表達量從7.49%提高至10.3%，而在389位 ATA→ATT的突變則對蛋白表達量并沒有產生顯著影響。此外，有文獻報道對表達影響較大的 AGA、GGG等稀有密碼子在此體系下對腸毒素O的表達量影響并不是特別顯著，這可能與密碼子優化順序或稀有密碼子的所處位置有關。有文獻報道，在不同位置插入稀有密碼子AGG會導致鏈激酶在大腸桿菌中的過表達或者不表達［14］，提示稀有密碼子類型及其所在分子環境(位置)共同決定了該稀有密碼子對蛋白表達水平的作用程度。

本實驗采用了親和層析、陰離子層析、超濾等方法，并通過Western blot鑒定，獲得了純度較高的目的蛋白。此方法較為簡單、快捷，有助于質量標準的建立以及減少毒副反應。而淋巴細胞增殖試驗表明，采用不同方式獲得的重組腸毒素O同樣具備超抗原活性。

綜上所述，本實驗通過密碼子的優化，較大幅度提高了腸毒素O在大腸桿菌中的異源蛋白表達水平，證實了稀有密碼子對蛋白質表達水平確實存在一定的影響，并且提出了假設:稀有密碼子類型及其所在分子環境(位置)共同決定了該稀有密碼子對蛋白表達水平的作用程度，通過生物學實驗對所得蛋白進行了活性鑒定，為大腸桿菌中異源蛋白表達、SEO作用機制的進一步研究，以及靶向資料奠定了基礎。

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Codon optimization of recombinant staphylococcal enterotoxin O enhances the expression level in Escherichia coli

HUANG Peng，SUN Hong-ying，CHEN Shu-qing
(Institute of Pharmacology，Toxicology and Biological Pharmaceutics，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou，310058，China)

Objective:To enhance the expression level of staphylococcal enterotoxin O(SEO)by optimization of rare codons.Methods:The gene of mature SEO(His-tag included)was cloned to pET28a，and 15 rare codons on the gene were optimized by PCR technology.These recombinant plasmids then were transformed into E.coli BL21(DE3)，respectively.After IPTG induced，the expression levels of those mutants were analyzed by SDS-PAGE.The proteins were purified and their bioactivities were determined.Results:After the optimization of rare codons，the expression levels were increased from 7.49%to 19.8%in total cell proteins.The optimized SEO had bioactivity to stimulate the proliferation of murine lymphocytes，which was equivalent to that of non-optimized SEO in vitro.Conclusion:Optimization of rare codons can enhance the expression of SEO effectually.

Staphylococcus aureus/immunol;Enterotoxins/immunol;Codon;Gene expression;Genetic vectors;Plasmids;Mutation;Cell proliferation;Lymphocytes

Q 343

A

1008-9292(2011)03-0297-07

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.03.012

2010-10-18

2011-03-31

黃 鵬(1987-)，男，碩士研究生.

陳樞青(1961-)，男，博士生導師，主要從事微生物與生化制藥研究;E-mail:chenshuqing@zju.edu.cn

［責任編輯 黃曉花］