結直腸癌ZIC1和KLOTHO基因啟動子甲基化檢測的臨床價值初探

甘麗虹，潘 潔，陳淑潔，鐘 菁，王良靜

(1.浙江大學醫學院附屬第二醫院消化科，浙江 杭州 310009;2.浙江大學邵逸夫臨床醫學研究所消化研究室，浙江 杭州 310016)

結直腸癌是目前世界上發病率排名第三的惡性腫瘤［1］。結直腸癌的發生是一個涉及多基因遺傳學和表觀遺傳學改變的累積過程，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活［2］。DNA甲基化是表觀遺傳學改變的一種主要形式，在抑癌基因的失活機制中扮演著重要角色［3］。研究表明，DNA異常甲基化在結直腸癌的發生發展中起重要作用，多種基因DNA甲基化有可能成為結直腸癌診斷和預后判斷的重要標志物［4-5］。

我們曾通過cDNA微陣列分析(cDNA microarray)進行基因組掃描和甲基化研究，發現ZIC1和KLOTHO基因的表達可能受到DNA甲基化的調控［6］。但有關ZIC1和KLOTHO在結直腸癌中的表達及相關調控機制尚不清楚。

ZIC是1994年Aruga在成年鼠小腦中發現的一類編碼鋅指結構蛋白的基因，包括ZIC 1～5共5個成員，其中ZIC1位于3q24，含3個外顯子，編碼一種C2H2型鋅指蛋白［7］。多個研究報道，ZIC1在神經腦發育中發揮重要作用［8-9］;而且，其與多種腫瘤如髓母細胞瘤、子宮內膜癌、間質腫瘤和胃癌的發生、發展關系密切［6，10-12］。KLOTHO 是 1997 年 Kuro 等人首先從衰老表現的小鼠模型中克隆成功［13-14］;研究發現，KLOTHO基因功能缺陷是導致衰老的重要原因，但KLOTHO可能還具有抑癌基因的功能［15］。本研究主要探討ZIC1和KLOTHO基因啟動子甲基化對結直腸癌臨床診斷的潛在價值。

1 材料和方法

1.1 材料 25對結直腸癌組織及癌旁組織均取自浙江大學邵逸夫醫院外科手術標本。Trizol購自 Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)和TaqGold DNA聚合酶購自Applied Biosystems公司，實時熒光定量 PCR試劑盒(SYBR PremixEx Taq PCR)購自Takara公司，EZ DNA Methylation-Gold Kit購自Zymo Research公司。

1.2 方法

1.2.1 病例 入選結直腸癌患者25例，其中男性16人，平均年齡64歲;女性9人，平均年齡61.33歲。術中取癌和癌旁相對正常的兩處組織標本，手術標本均經有豐富經驗的病理科醫師明確診斷。其中，高分化腺癌17例，中分化腺癌7例，低分化腺癌1例。癌旁組織經病理證實為無癌細胞的相對正常組織。TNM分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期(ⅡA、ⅡB)10例，Ⅲ(ⅢA、ⅢB、ⅢC)9例，Ⅳ期1例。

1.2.2 實時熒光定量PCR 按照試劑說明書用Trizol試劑提取結直腸癌組織及相應癌旁組織 RNA，并逆轉錄為 cDNA，按照 SYBR PremixEx Taq PCR試劑盒說明書操作PCR，并以GAPDH作為內參照。反應體系20 μl，反應條件:95℃變性2 min，然后變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共35個循環;最后72℃延伸10 min，并進行溶解曲線分析及1.5%瓊脂糖凝聚電泳驗證擴增的特異性。每個樣本均檢測3次，取其平均值計算 ZIC1、KLOTHO mRNA的表達水平。用-△△CT法計算ZIC1和KLOTHO mRNA在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達變化。PCR反應引物設計:ZIC1正義:5'-AAACTGGTTAACCACATC CGC，反 義:5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG;KLOTHO正義:5'-ACCTGGTGGCGCACAACC，反義:5'-TTGGCAAACCAACCTAGTACA;GAPDH正義:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT，反義:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC。

1.2.3 DNA的亞硫酸鹽處理及甲基化特異性PCR 提取結直腸癌組織及癌旁組織的DNA，取500 ng DNA進行亞硫酸鹽處理，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說明書進行操作，取處理后的 DNA 1 μl作為模板使用 TaqGold DNA聚合酶進行甲基化特異性PCR擴增，反應體系 12.5 μl，反應條件:95℃變性 10 min，然后變性95℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共40個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，在紫外檢測儀上觀察產物條帶。相關引物:ZIC1(M)正義:5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC，反義:5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG;ZIC1(U)正義:5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT，反義:5'-CCCATTAACCACATTAAACA;KLOTHO(M)正義:5'-GTCGTCGTTGTAGTTCGTTATC，反 義: 5'-CAACAAACGCCGATAATAACG;KLOTHO(U)正義:5'-TTGTTGTTGTTGTAG TTTGTTATT，反義:5'-CCAACAAACACCAATA ATAAC。(M):甲基化引物;(U):非甲基化引物。

1.2.4 統計方法 使用 GraphPad Prism 5.0數據分析軟件進行數據統計，結直腸癌和癌旁組織ZIC1和KLOTHO mRNA相對表達情況用-△△CT值的中位數(25% ～75%四分位間距)描述，采用配對Wilcoxon等級秩和檢驗分析;ZIC1和KLOTHO mRNA表達與臨床病理資料關系采用非參數Mann Whitney和Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Dunn's多重檢驗;ZIC1和KLOTHO啟動子甲基化與臨床病例資料相關性采用Fisher精確檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZIC1和KLOTHO mRNA在結直腸癌組織中的表達明顯下調 以GAPDH作為內參照，實時熒光定量PCR結果顯示:與癌旁正常組織相比，ZIC1和KLOTHO mRNA在結直腸癌組織中的表達均明顯下調(P均＜0.0001)，見表1。進一步分析ZIC1和KLOTHO mRNA表達與臨床病理資料的關系，發現結直腸癌組織ZIC1 mRNA相對定量表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及腫瘤TNM分期無明顯相關(P＞0.05);KLOTHO mRNA表達與患者年齡分布有顯著相關性(P＜0.05)，而與患者性別、腫瘤分化程度及腫瘤TNM分期無明顯相關(P＞0.05)，見表 2、表 3。

2.2 結直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因啟動子高甲基化 甲基化特異性PCR(MSP)結果顯示，在25例結直腸癌組織中ZIC1甲基化陽性率為80%(20/25)，KLOTHO甲基化陽性率為76%(19/25)，ZIC1和KLOTHO聯合甲基化的陽性率為64%(16/25)。在檢測標本中，部分癌旁正常組織出現較癌組織弱的甲基化(M)表達條帶，說明組織學上相對正常的結腸癌旁組織可以發生部分甲基化(圖1)。

表1 實時熒光定量RT-PCR檢測結直腸癌和癌旁組織中ZIC1和KLOTHO mRNA表達Table 1 The result of real-time quantitative RT-PCR analysis of ZIC1 and KLOTHO mRNA expression in colorectal cancer and adjacent non-tumor tissues (n=25，中位數，25% ～75%)

表2 結直腸癌ZIC1 mRNA表達與臨床病理資料的關系Table 2 The relationship between the expression of ZIC1 mRNA and clinicopathological features in colorectal cancers(n=25，中位數，25% ～75%)

圖1 MSP檢測結直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因啟動子甲基化表達Fig.1 The promoter methylation status of ZIC1 and KLOTHO were detected by methylation specific PCR(MSP)in colorectal cancer and adjacent nontumor tissues

表3 結直腸癌KLOHTO mRNA表達與臨床病理資料的關系Table 3 The relationship between the expression of KLOTHO mRNA and clinicopathological features in colorectal cancers(n=25，中位數，25% ～75%)

進一步對ZIC1和KLOTHO甲基化狀態和臨床病理資料進行統計，發現ZIC1和KLOTHO同時甲基化與年齡分布相關(P＜0.05)，但與患者性別、腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期無明顯相關性(P ＞0.05)，見表4。

3 討論

結直腸癌的發生是遺傳學和表觀遺傳學改變共同作用的結果［16］。表觀遺傳學改變主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑等［17］。基因異常甲基化在腫瘤發生發展中是一種頻發的早期事件，其不但在組織中可被檢測到，在外周血、尿液、膽汁等體液中也能檢測到［18］，具有重要的臨床診斷和應用價值。

表4 結直腸癌中ZIC1和KLOHTO甲基化與臨床病理特點Table 4 The correlation between ZIC1 and KLOTHO DNA methylation and clinicopathological features in colorectal cancers

本研究發現，ZIC1和KLOTHO基因在結直腸癌中的表達較癌旁組織明顯下調;在結直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因啟動子普遍存在高甲基化現象，ZIC1甲基化陽性率為80%(20/25)，KLOTHO甲基化陽性率為76%(19/25)，聯合陽性率達64%(16/25)。因此，我們推測ZIC1和KLOTHO的表達下調可能受到啟動子高甲基化等表觀遺傳學調控。在部分結腸癌旁組織發生ZIC1和KLOTHO甲基化現象，其主要原因可能為:①這些組織在病理形態學上是正常的，但部分細胞在分子水平上已經發生了甲基化，故癌旁組織實際上是相對正常組織;②甲基化特異性PCR(MSP)方法極度敏感，經過PCR擴增后能發現0.1%比例甲基化DNA，癌旁組織出現較弱的甲基化(M)條帶。再者，甲基化可能是結腸癌發生的早期分子事件。本研究還觀察到KLOTHO mRNA表達與患者年齡間有相關性，尤以50歲以后年齡段，隨著年齡的遞增，KLOTHO mRNA表達呈遞減趨勢，這可能與既往研究報道KLOTHO基因參與人類衰老過程相關［14］。

前期體外細胞學實驗表明，ZIC1使胃癌細胞周期停滯，并抑制細胞增殖而發揮抑癌作用［6］。近年研究發現，KLOTHO基因在乳腺癌細胞中具有抑癌功能［15］，研究顯示 KLOTHO表達乳腺癌組織較正常組織明顯降低，過表達KLOTHO使乳腺癌細胞株MCF7和MDA-MB-231增殖抑制。有關ZIC1和KLOTHO在結直腸癌中是否具有腫瘤抑制作用值得進一步的實驗研究。

綜上，在結直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因表達顯著下調，ZIC1和KLOTHO基因發生高頻率啟動子甲基化，聯合檢測 ZIC1和KLOTHO基因啟動子甲基化狀態對結直腸癌診斷具有潛在的應用價值。

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