NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究

張 薇，沈 權(quán)，彭正羽

NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究

張 薇1，沈 權(quán)1，彭正羽2

(1.浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310015;2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海200032)

目的：建立可用于前體mRNA可變剪接分析的NCAM L1小基因模型。方法：以人基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得NCAM L1小基因片段，并將其克隆至真核表達(dá)載體中，構(gòu)建小基因的質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，用NCAM L1小基因模型轉(zhuǎn)染HeLa、COS-1、PFSK及R28細(xì)胞，并用RT-PCR進(jìn)行被剪接的小基因產(chǎn)物的半定量檢測(cè)。結(jié)果：NCAM L1小基因在4種細(xì)胞中的剪接模式不同，在PFSK以及Hela細(xì)胞中，存在2種剪接亞型，而在COS-1以及R28細(xì)胞中只有一種剪接亞型存在。結(jié)論：所構(gòu)建的NCAM L1小基因可用于細(xì)胞水平的基因剪接分析。

Hela細(xì)胞;質(zhì)粒;遺傳載體;剪接體;NCAM L1;小基因;前體mRNA;可變剪接

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(4):427-431.］

前體mRNA的剪接是基因表達(dá)調(diào)控中的重要環(huán)節(jié)，目前已知兩種互相關(guān)聯(lián)的剪接方式:組成性剪接和可變剪接［1］。在組成性剪接中，剪接位點(diǎn)不因細(xì)胞種類發(fā)育階段或環(huán)境而改變，因而最終形成的基因及其表達(dá)產(chǎn)物也是不變的。而可變剪接則不然，通過(guò)可變剪接過(guò)程可以將前體mRNA的外顯子選擇性地組合、連接在一起，并最終表達(dá)出功能各異的、甚至完全相反的蛋白質(zhì)亞型［2］。前體mRNA的剪接是在“剪接復(fù)合體”中進(jìn)行的，剪接復(fù)合體包含snRNPs(small nuclear ribonucleoproteins)、hnRNPs(hetero-geneous nuclear ribonucleoproteins)和 SR(serine/arginine-rich)蛋白及其相關(guān)蛋白［3-4］。調(diào)控可變剪接的因素包括順式元件和反式調(diào)節(jié)因子［5-6］。

在前體mRNA可變剪接的研究中，小基因模型是一種新發(fā)展起來(lái)的有效的研究手段［7-8］。所謂小基因是基因中的一個(gè)片段，可用于基因的功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究，因其片段短而得名。用于組成型剪接分析的小基因模型通常僅包含2個(gè)外顯子和它們之間的1個(gè)內(nèi)含子;用于可變剪接分析的小基因除包含2個(gè)相鄰的在剪接時(shí)被二選一剪接的外顯子外，還包含它們兩側(cè)的外顯子及這些外顯子之間的內(nèi)含子。

人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(Human Neural cell adhesion molecule L1，NCAM L1)屬于免疫球蛋白超家族的成員［9］，其在神經(jīng)元細(xì)胞以及其它細(xì)胞中的表達(dá)存在差別，表現(xiàn)在對(duì)2號(hào)外顯子以及27號(hào)外顯子的可變剪接方式不同。在神經(jīng)元細(xì)胞中，成熟的NCAM L1 mRNA包含2號(hào)外顯子以及27號(hào)外顯子，而在非神經(jīng)元細(xì)胞中，成熟的NCAM L1 mRNA不包含2號(hào)外顯子和27號(hào)外顯子［10］。研究者已經(jīng)證實(shí)，NCAM L1在神經(jīng)細(xì)胞的分化以及遷移中發(fā)揮重要作用，同時(shí)，在腫瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移中也有作用［11-12］。

為深入研究NCAM L1的可變剪接機(jī)制，本研究建立了NCAM L1其2號(hào)外顯子可被可變剪接的小基因模型(小基因結(jié)構(gòu)及其剪接模式見(jiàn)圖1)，并研究了該小基因模型在Hela、COS-1、PFSK及R28等幾種不同細(xì)胞系中的可變剪接模式，證實(shí)該小基因模型可以用于細(xì)胞水平的基因剪接分析。

圖1 NCAM L1小基因結(jié)構(gòu)及其剪接模式Fig.1 The structure and splicing pattern of NCAM L1 minigene

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 Taq酶、XbaⅠ、BamHⅠ內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自New England公司;MLV-RT酶以及 RNasin，dNTPs購(gòu)自 Promega公司;oligo(dT)18購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染用 Lipofectiamine試劑盒購(gòu)自GIBCO/BRL公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 質(zhì)粒 pCRII質(zhì)粒以及 pcDNA3.1/myc-His(-)A表達(dá)載體購(gòu)自Promega公司。

1.1.3 菌株 DH5α 為Clontech公司產(chǎn)品。

1.1.4 細(xì)胞株 Hela、COS-1、PFSK 及 R28細(xì)胞均來(lái)源于 ATCC，Hela、COS-1及 R28用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)。PFSK用含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小基因質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證 在NCAM L1小基因兩端設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，其中正向引物含有內(nèi)切酶BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，反向引物含有內(nèi)切酶XbaⅠ的酶切位點(diǎn)。引物序列為:正向(L1-F):5'-ACGGATCCGATGGTCGTGGCG CTGCGG-3';反向(L1-R):5'-GCTCTAGAGGCT GAGACGGCAGATCAC-3'。以胎兒腦組織基因組DNA為模板，上述序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為 94℃變性5 min;94℃，30 s;64℃，30 s;72℃，5 min;35 個(gè)循環(huán)，72℃，7 min，擴(kuò)增出一條約3.3 kb的小基因序列，將其克隆到載體pCRⅡ中并測(cè)序驗(yàn)證。用這兩種內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后即可克隆入pCDNA3.1質(zhì)粒載體。質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切以及測(cè)序鑒定為含有 NCAM L-1的 Exon1、2、3以及Intron的小基因。

1.2.2 細(xì)胞的短暫共轉(zhuǎn)染 將含有NCAM L1小基因的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NCAM L1，轉(zhuǎn)染Hela、COS-1、PFSK及 R28細(xì)胞，以觀察在不同類型細(xì)胞中小基因的剪接情況。實(shí)驗(yàn)中以小基因的空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染通過(guò)lipofectamine介導(dǎo)，方法參見(jiàn)GIBCO/BRL公司操作說(shuō)明。大致步驟為:在直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中以5×105細(xì)胞/皿的密度接種細(xì)胞，次日以小基因質(zhì)粒2 mg分別轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞，30 h后收集細(xì)胞，抽提RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA。以上述cDNA為模板，載體上的T7 primer作為正向引物，上述的反向引物通過(guò)PCR擴(kuò)增細(xì)胞外源性的NCAM L1的剪接產(chǎn)物。通過(guò)電泳條帶以及測(cè)序鑒別其可變剪接結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 用于剪接分析的小基因的構(gòu)建和驗(yàn)證所構(gòu)建小基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-His-NCAM L1的酶切驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。用BamHⅠ+XbaⅠ雙酶切后，得到3.3 kb的小基因片段和5.4 kb的載體片段，兩個(gè)片段的分子量均和理論上預(yù)期的相符，且與PCR擴(kuò)增目的條帶大小一致。上述結(jié)果表明，所構(gòu)建的小基因表達(dá)質(zhì)粒準(zhǔn)確無(wú)誤。

2.2 在不同細(xì)胞中NCAM L1小基因的剪接模式 用我們構(gòu)建的小基因分別轉(zhuǎn)染Hela、COS-1、PFSK及R28細(xì)胞后，NCAML 1小基因的可變剪接結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖所示，在PFSK細(xì)胞以及Hela細(xì)胞中，NCAM L1小基因的剪接產(chǎn)物為大小分別約為190 bp以及170 bp的兩個(gè)條帶，測(cè)序結(jié)果證實(shí)這兩個(gè)條帶中，分子量較大的條帶包含2號(hào)外顯子，而另一條帶不含2號(hào)外顯子。結(jié)果說(shuō)明在這兩種細(xì)胞中，小基因可以被剪接產(chǎn)生兩種亞型，即包含2號(hào)外顯子以及不含2號(hào)外顯子的剪接亞型。而在R28以及COS-1細(xì)胞中，只存在一種大小為170 bp的條帶，說(shuō)明小基因在這兩種細(xì)胞內(nèi)通過(guò)剪接只能產(chǎn)生一種亞型，即不含2號(hào)外顯子的剪接亞型。

圖2 小基因質(zhì)粒酶切電泳鑒定Fig.2 NCAM L1 minigene identification by BamHⅠ and XbaⅠ digestion

圖3 NCAM L1小基因在不同細(xì)胞中的剪接模式Fig.3 The splicing pattern of NCAM L1 minigene in 4 cell lines

3 討論

人類基因組計(jì)劃研究表明，人類的基因組包含約40 000個(gè)基因［13］，但是人體內(nèi)蛋白的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于此數(shù)。其主要原因即在于基因可變剪接的多樣性，使這些基因的編碼容量大大增加。研究證實(shí)，同一基因在不同的條件下，可以編碼的亞型最多可達(dá)數(shù)千個(gè)［14］。最近的研究表明，超過(guò)70%的人類基因都有兩個(gè)或更多的剪接亞型存在［15］?？勺兗艚硬粌H存在于生命體的正常生理活動(dòng)，如發(fā)育、分化以及性別決定等過(guò)程中，還在一些疾病特別是腫瘤的發(fā)生中也扮演著重要角色。如多位作者證實(shí)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在星形膠質(zhì)瘤的惡化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［16］。FGFR1的α外顯子經(jīng)過(guò)可變剪接可以產(chǎn)生兩種亞型，即包含α外顯子的FGFR1α以及不含α外顯子的FGFR1β。FGFR1在正常的蛋白質(zhì)以及低級(jí)別的星形細(xì)胞瘤中表達(dá)很少或無(wú)表達(dá)，但在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)較高且只表達(dá)可變剪接亞型FGFR1β。中間程度的膠質(zhì)瘤FGFR1的表達(dá)則是由 FGFR1α到 FGFR1β變化［17］。

NCAM L1主要以同親和或異親和等多種方式實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元間相互作用，從而影響細(xì)胞遷移和神經(jīng)元軸、樹(shù)突投射及突觸定位，以及作為輔助受體參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)［18］。NCAML1細(xì)胞黏附分子缺陷的小鼠會(huì)出現(xiàn)發(fā)育遲滯、空間學(xué)習(xí)和探索能力不足等表現(xiàn)［19］。此外，NCAM L1還參與腫瘤細(xì)胞侵襲［20］，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Izumoto等人在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了NCAM L1的剪接亞型NCAM L1cs的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該亞型可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的黏附以及遷移中發(fā)揮重要作用［21-22］，提示 NCAM L1的可變剪接與膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性相關(guān)。相比體外基因剪接分析模型，體內(nèi)小基因剪接分析方法建立在細(xì)胞水平上，更接近其在生物體內(nèi)的真實(shí)情況。因此，本研究構(gòu)建了NCAM L1的小基因模型，并將其轉(zhuǎn)染到 PFSK、Hela、R28以及COS-1細(xì)胞中。R28是一種永生化的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，而COS-1細(xì)胞來(lái)源于非洲綠猴腎細(xì)胞，均非腫瘤細(xì)胞，NCAM L1小基因通過(guò)可變剪接后只存在一種不含2號(hào)外顯子的剪接亞型，與其在正常組織中的剪接一致。而PFSK是來(lái)源于人類的原始神經(jīng)外胚層腫瘤細(xì)胞，Hela是人類宮頸癌細(xì)胞，NCAM L1小基因通過(guò)剪接后能產(chǎn)生兩種剪接亞型，提示這種剪接形式可能與腫瘤相關(guān)。因此，通過(guò)研究NCAM L1小基因在不同的細(xì)胞中不同的剪接模式，將有助于我們研究NCAM L1在正常生理?xiàng)l件下以及包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的疾病中的作用及其分子機(jī)制。

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Establishment of NCAM L1 minigene model and its splicing patterns in different cell lines

ZHANG Wei1，SHEN Quan1，PENG Zheng-Yu2
(1.School of Medicine and Life Science，Zhejiang University City College，Hangzhou 310015，China;2.Institute of Biomedical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China)

Objective:To establish a minigene model of neural cell adhesion molecule L1(NCAM L1)gene and to study its aplicing patterns in different cell lines.Methods:Using human genetic cDNA as template，the NCAM L1 minigene fragment was amplified and inserted into eukaryotic expression vector.The minigene was transfected into 4 cell lines and the splicing patterns of NCAM L1 minigene in these cell lines were studied.Results:The splicing patterns of NCAM L1 minigene were different in individual cell lines.In PFSK and Hela cell lines，two splicied isoforms were generated but in COS-1 and R28 cell lines，only one isoform existed.Conclusion:NCAM L1 minigene model can be used in alternative splicing analysis.

Hela cells;Plasmids;Genetic vectors;Spliceosomes;NCAM L1;Mini-gene;Pre-mRNA;Alternative splicing

Q 753

A

1008-9292(2011)04-0427-05

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.04.014

2011-04-18

2011-05-15

浙江省教育廳科研資助項(xiàng)目(Y201017203).

張 薇(1976-)，女，碩士，講師，主要從事分子生物學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)研究.

彭正羽(1970-)，男，博士，主要從事分子生物學(xué)研究;E-mail:zhypeng@fudan.edu.cn

［責(zé)任編輯 張榮連］