阿司匹林通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1途徑抑制人臍動(dòng)脈平滑肌增殖的實(shí)驗(yàn)研究

王 林 黃體鋼 李廣平 曹 路 周麗娟 劉紅梅 甄 琴

阿司匹林通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1途徑抑制人臍動(dòng)脈平滑肌增殖的實(shí)驗(yàn)研究

王 林 黃體鋼 李廣平 曹 路 周麗娟 劉紅梅 甄 琴

目的：探討阿司匹林對(duì)人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)增殖的影響及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1信號(hào)途徑在其中可能發(fā)揮的作用。方法利用HUASMCs進(jìn)行體外培養(yǎng)；通過MTT法觀察不同濃度阿司匹林(0.5、1.0、2.0及5.0 mmol/L)以及加入TGF-β1中和抗體后對(duì)細(xì)胞增殖（OD值）的影響；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測阿司匹林(2.0 mmol/L)以及加入TGF-β1中和抗體后對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果不同濃度阿司匹林(0.5、1.0、2.0及5.0 mmol/L)及加入TGF-β1中和抗體培養(yǎng)HUASMC細(xì)胞后，其數(shù)量（OD值）組間、時(shí)間效應(yīng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且組間與時(shí)間效應(yīng)間存在交互作用(P<0.05)。阿司匹林（2.0 mmol/L）可使HUASMCs的增殖阻滯在G0/G1期(P<0.05)，TGF-β1中和抗體可使A2.0組的細(xì)胞G0/G1期減少，S期增多（P<0.05）。結(jié)論阿司匹林可使HUASMCs的增殖阻滯于G0期從而抑制HUASMCs增殖，這種抑制作用可能在一定程度上是通過TGF-β1信號(hào)途徑所介導(dǎo)的。

臍動(dòng)脈 肌,平滑,血管 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 阿司匹林 體外研究 轉(zhuǎn)化生長因子β1

近年來阿司匹林作為經(jīng)典的治療冠心病的藥物，越來越受到重視，研究認(rèn)為其可能通過作用于血管壁帶來“額外”的益處，且對(duì)于治療和預(yù)防粥樣硬化晚期并發(fā)癥有一定意義，但機(jī)制尚不明確[1-2]。除通過抑制環(huán)氧化酶發(fā)揮抗血小板的聚集作用外，阿司匹林還可以通過抑制增生、對(duì)抗血管炎癥反應(yīng)等途徑來增加斑塊的穩(wěn)定性[3]。此前研究認(rèn)為阿司匹林的抑制作用是通過轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)的[3]。本研究旨在通過體外培養(yǎng)，觀察阿司匹林通過TGF-β1途徑對(duì)人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HUASMCs）增殖的影響，從而對(duì)該藥物在臨床治療方面的潛在機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

1 材料與方法

1.1材料 HUASMCs來源：選取產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌條件下分離動(dòng)脈，采用植塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得。一次性培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司），F(xiàn)ACSVantage SE?多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀（美國BD Bioscience公司），Multiskan MK3酶標(biāo)儀（ThermoLabsystems公司），TLLC臺(tái)式高速低溫離心機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；RPMI 1640培養(yǎng)液（含碳酸氫鈉、HEPES、L-谷氨酰胺，GIBCO BRL公司），胎牛血清、人AB血清及0.25%胰蛋白酶消化液（HQ?TRYPSIN，Hyclone公司），阿司匹林原粉、血小板源性生長因子（PDGF）、MTT及二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，0.01 mol/L PBS（Solarbio公司）；Cycle TestTMPlus DM 細(xì)胞周期檢測試劑盒（BD Bioscience公司）。鼠抗人TGF-β1中和抗體（TGF-β1 Ab，Abazyme公司），乳酸脫氫酶檢測試劑盒（北京中生公司）。

1.2分組 對(duì)HUASMCs進(jìn)行原代培養(yǎng)并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法鑒定VSMC內(nèi)的α-actin蛋白；MTT比色法測定細(xì)胞增殖活力[3-4]。在PDGF（10 μg/L）的作用下，向含不同濃度0.5、1.0、2.0及5.0 mmol/L阿司匹林的培養(yǎng)液中加入TGF-β1 Ab（50 mg/L）成為以下幾個(gè)觀察組：C組為空白對(duì)照組,僅加入無血清 RPMI 1640培養(yǎng)液；P 組為僅加入 PDGF（10 μg/L）；A0.5、A1.0、A2.0、A5.0組為加入PDGF（10 μg/L）及阿司匹林濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L；C+Ab組為加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)液和TGF-β1 Ab（50 mg/L）；P+Ab組為加入PDGF（10 μg/L）+TGF-β1 Ab（50 mg/L）；A0.5+Ab、A1.0+Ab、A2.0+Ab、A5.0+Ab組分別為加入PDGF（10 μg/L）+TGF-β1 Ab（50 mg/L）及阿司匹林濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L，每組重復(fù)4孔。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 （1）接種細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長期的HUASMCs細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞，用含10%胎牛血清+10%人AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。（2）培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)1～6 d。（3）呈色：分別在培養(yǎng)第1、3、6天，每孔加入0.5%MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，使甲臢充分溶解。（4）比色：選擇490 nm波長，在用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光密度值（OD值），記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制生長曲線。各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取得是同批的孔，且各濃度OD值在96孔板中同一濃度重復(fù)4孔取平均值。

1.4HUASMC細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞技術(shù)[4]取上述C組、C+Ab組、A2.0組、A2.0+Ab組進(jìn)行觀察。將阿司匹林（2.0 mmol/L）與對(duì)數(shù)生長期的HUASMC細(xì)胞作用24 h后，PBS沖洗，0.25%胰酶消化收集制成密度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，加入4℃預(yù)冷的70%乙醇，混勻，4℃保存，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.5細(xì)胞毒性檢測 采用乳酸脫氫酶法[4]：常規(guī)消化細(xì)胞，離心后把細(xì)胞調(diào)成104/mL，接種于24孔板，每孔l mL，共24孔，細(xì)胞貼壁后，按照上述分組方式，分別加入與C組和A5.0組相同的處理因素。培養(yǎng)24 h后，取上清液，用生化比色法檢測血清中活性乳酸脫氫酶(LDH)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料用x ±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量資料的方差分析，進(jìn)一步組間比較選用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 原代培養(yǎng)5～12 d，相差倒置顯微鏡下可見有梭形細(xì)胞從組織塊邊緣長出，以后細(xì)胞增殖，縱行排列向外生長延伸，2～3周出現(xiàn)致密的細(xì)胞層可長滿瓶底。細(xì)胞經(jīng)α-actin免疫組織化學(xué)鑒定，顯微鏡下可見細(xì)胞的胞漿為橙黃色，呈陽性結(jié)果，表明培養(yǎng)細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。傳代培養(yǎng)4～7代，細(xì)胞長滿瓶底時(shí)，表現(xiàn)為收縮型（分化型），可見平滑肌細(xì)胞呈梭形，平行生長，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯(cuò)呈“峰谷”狀，選取4～7代細(xì)胞用于本研究。

2.2阿司匹林及TGF-β1 Ab對(duì)HUASMC增殖的影響 不同濃度阿司匹林(0.5、l.0、2.0及5.0 mmol/L)培養(yǎng)HUASMC細(xì)胞數(shù)量（OD值）組間、時(shí)間效應(yīng)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且組間與時(shí)間效應(yīng)間存在交互作用(P<0.05)，見表1。

表1 阿司匹林及TGF-β1 Ab對(duì)HUASMC增殖的影響（OD值，n=4，

表1 阿司匹林及TGF-β1 Ab對(duì)HUASMC增殖的影響（OD值，n=4，

=5.287=1 235.408=2.307，均P<0.05

C組P組A0.5組A1.0組A2.0組A5.0組C+Ab組P+Ab組A0.5+Ab組A1.0+Ab組A2.0+Ab組A5.0+Ab組0.278±0.021 0.282±0.052 0.279±0.021 0.275±0.042 0.277±0.046 0.273±0.042 0.283±0.019 0.300±0.033 0.270±0.028 0.274±0.032 0.273±0.033 0.267±0.040 0.410±0.053 0.462±0.062 0.430±0.050 0.428±0.063 0.398±0.052 0.377±0.045 0.459±0.018 0.464±0.036 0.457±0.035 0.452±0.038 0.448±0.046 0.435±0.061 0.675±0.051 0.765±0.061 0.656±0.046 0.645±0.039 0.630±0.046 0.563±0.036 0.737±0.043 0.780±0.065 0.706±0.033 0.701±0.030 0.699±0.031 0.697±0.057組別1 d 3 d 6 d

2.3阿司匹林對(duì)HUASMCs細(xì)胞周期作用的影響 A2.0組G0/G1期細(xì)胞百分率較C組有所增加，A2.0+Ab組G0/G1期細(xì)胞百分率較A2.0組有所減低，但仍高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；A2.0組的S期細(xì)胞百分率低于C組，A2.0+Ab組S期細(xì)胞百分率較A2.0組有所增加，但仍低于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 阿司匹林（2.0 mmol/L）及TGF-β1 Ab對(duì)HUASMCs細(xì)胞周期的影響

表2 阿司匹林（2.0 mmol/L）及TGF-β1 Ab對(duì)HUASMCs細(xì)胞周期的影響

＊P<0.05,＊＊P<0.01

組別 G0/G1期 S期 G2/M期C組(1)A2.0組(2)A2.0+Ab組(3)F q（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）86.37±2.65 93.09±0.55 90.38±0.32 18.457**8.541*5.094*3.983*8.37±2.22 3.09±0.07 5.22±0.48 16.430**6.281*4.689*3.915*5.26±3.39 3.82±0.58 4.41±0.73 0.510---

2.4乳酸脫氫酶法檢測細(xì)胞毒性 在阿司匹林（5.0 mmol/L）作用下，HUASMCs釋放LDH-C水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（51.6±6.62）IU/L vs（54.8±4.69）IU/L，t=0.789，P>0.05）］。

3 討論

TGF-β是一類多功能的細(xì)胞因子，在維持動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要的作用[5]；體內(nèi)研究證實(shí)激活TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能為粥樣硬化病變治療提供新的靶點(diǎn)[6]。自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)阿司匹林具有抑制前列腺素合成作用以來，其臨床用途不斷增多，特別是在心腦血管疾病的防治方面可明顯減少急性心肌梗死后近期和遠(yuǎn)期的病死率，以及再梗死的發(fā)生率[7]。而這些臨床效果己不能單純地用抗血小板聚集的作用來解釋。研究表明，小劑量阿司匹林在不影響前列環(huán)素（PGI2）的情況下能通過降低炎癥因子的水平，改善血管炎癥反應(yīng)狀態(tài)及斑塊的組成使其更加穩(wěn)定；而大劑量阿司匹林則可通過影響細(xì)胞周期來抑制血管平滑肌的增殖[8]。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林可導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制，與相關(guān)研究［8-9]結(jié)果相近。LDH檢測未發(fā)現(xiàn)阿司匹林增加細(xì)胞毒性，表明這種抗增殖作用不是由于藥物的細(xì)胞毒性所引起的。該抑制效應(yīng)在阿司匹林作用第6天最為明顯，且可被TGF-β1 Ab所逆轉(zhuǎn)。通過流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)阿司匹林(2 mmol/L)可使G0/G1期的細(xì)胞百分率增多，S期的細(xì)胞百分率減少，而G2/M期的細(xì)胞百分率無顯著變化，表明阿司匹林是通過對(duì)G0/G1期的阻滯而抑制VSMC的增殖，與上述研究結(jié)果［3，8-9］一致。此外,本研究結(jié)果顯示在加入TGF-β1 Ab后，G0/G1期比例下降，而S期比例上升，減弱了阿司匹林對(duì)G0/G1期的阻滯作用，提示TGF-β1及其下游信號(hào)途徑可能參與了阿司匹林抑制細(xì)胞增殖的作用。近年來人們對(duì)于阿司匹林抑制VSMCs增殖的多種作用機(jī)制進(jìn)行了探索[3-7]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，筆者認(rèn)為阿司匹林可使HUASMCs的增殖阻滯于G0期從而抑制HUASMCs增殖，這種抑制作用可能在一定程度上是通過TGF-β1信號(hào)途徑所介導(dǎo)的。

[1] Jankowski J,Attwood S,deCaestecker J,et al.,Aspirin in the pri?mary prevention of vascular disease[J].Lancet,2009，374(9693):877-878.

[2] WolffT,MillerT,Ko S.Aspirin for the primary prevention of cardiovascular events:an update of the evidence for the U.S.Pre?ventive Services Task Force[J].Ann Intern Med,2009，150(6):405-410.

[3] Redondo S,Ruiz E,Gordillo-Moscoso A,et al.Role of TGF-be?ta1 and MAP kinases in the antiproliferative effect of aspirin in hu?man vascular smooth muscle cells[J].PLoS One,2010，5(3):e9800-e9807.

[4] Redondo S,Santos-Gallego CG,Ganado P,et al.Acetylsalicylic acid inhibits cell proliferation by involving transforming growth fac?tor-beta[J].Circulation,2003，107(4):626-629.

[5] Pennison M,Pasche B.Targeting transforming growth factor-beta signaling[J].Curr Opin Oncol,2007，19(6):579-585.

[6] Lutgens E,GijbelsM,Smook M,et al.Transforming growth fac?tor-beta mediates balance between inflammation and fibrosis dur?ing plaque progression[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002，22(6):975-982.

[7] Pyrgakis,VN.Aspirin in primary prevention[J].Hellenic J Cardiol,2009，50(5):441-442.

[8] Voisard R,FischerR,Osswald M,et al.Aspirin(5 mmol/L)in?hibits leukocyte attack and triggered reactive cell proliferation in a 3D human coronary in vitro model[J].Circulation,2001，103(12):1688-1694.

[9] Marra DE，Simoncini T,Liao JK.Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation by sodium salicylate mediated by upregula?tion of p21(Waf1)and p27(Kip1)[J].Circulation,2000，102(17):2124-2130.

The Inhibitory Effect of Aspirin on the Proliferation of Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells by Transforming Growth Factor β1

WANG Lin,HUANG Tigang,LI Guangping,CAO Lu,ZHOU Lijuan,LIU Hongmei,ZHEN Qin

Cardiology Department,Tianjin Chest Hospital,Tianjin 300051,China

Objective:To investigate the inhibitory effect of aspirin on the proliferation of human umbilical artery smooth muscle cells(HUASMCs),and the potential mechanisms of transforming growth factor（TGF）-β1 signaling thereof.Methods:HUASMCs were isolated and cultured in vitro with or without specific anti-TGF-β1 neutralizing antibody.The cell proliferation and cell cycles were measured by MTT and flow cytometry after treatment with different concentrations of as?pirin(0.5,l.0,2.0 and 5.0 mmol/L).Results:There were significant differences in the values of OD and time effects in HUASMCs treated with different concentrations of aspirin(0.5,1.0,2.0 and 5.0 mmol/L)with specific anti-TGF-β1 neutraliz?ing antibody(P<0.05).The G0/G1phase was restrained by aspirin（2.0 mmol/L）in HUASMCs(P<0.05).There was a de?crease in G0/G1phase and an increase in S phase by specific anti–TGF-β1 neutralizing antibody in HUASMCs with aspirin of 2.0 mmol/L(P<0.05).Conclusion:Aspirin,independent of its cytotoxicity,can inhibit the proliferation of HUASMCs in vitro,in which TGF-β1 signaling might be involved.

umbilical arteries muscle,smooth,vascular cell proliferation cell cycle aspirin in vitro trans?forming growth factor beta1

300051 天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科（王林,曹路）；天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科(黃體鋼,李廣平，周麗娟)；武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(劉紅梅)；上海市第一人民醫(yī)院(甄琴)

（2010-08-13收稿 2010-10-28修回）

（本文編輯 陸榮展）