一株高產淀粉酶枯草芽孢桿菌的篩選、鑒定及產酶條件的優化

陳相達，戴慧慧，劉燕，李圓圓，翁叢叢，茹波，曾愛兵

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.仁濟學院；2.生命科學學院）

一株高產淀粉酶枯草芽孢桿菌的篩選、鑒定及產酶條件的優化

陳相達1，戴慧慧1，劉燕1，李圓圓1，翁叢叢1，茹波1，曾愛兵2

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.仁濟學院；2.生命科學學院）

目的：篩選出α-淀粉酶高產菌株，對其發酵特性及分類鑒定進行研究，為豐富產淀粉酶菌種資源和進一步挖掘該菌株的應用價值奠定基礎。方法：通過初篩、復篩獲得高酶活菌株XW86，利用傳統的形態觀察、系統生理生化反應并結合16S rDNA的序列分析，經Blast序列比對構建其系統進化樹，確定其分類定位。通過單因素選擇實驗以及進一步的正交實驗和多因素交互實驗，進行產酶條件優化。結果：XW86與已報道的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisstrain QD517）親緣關系最近，二者的16S rDNA序列相似性為99%，生理生化反應譜與16S rDNA序列分析一致鑒定為枯草芽孢桿菌。XW86最適產酶條件為：在LB基礎培養基中添加0.75%吐溫、0.5%淀粉，初始pH 6.5，35 ℃培養120 h。液體發酵得到的粗酶液酶活可高達2200 U/dL，比優化前提高2.8倍。結論：初步鑒定XW86為枯草芽孢桿菌，產酶因素的最佳組合對其淀粉酶活性有很大的優化空間。該野生型菌株可為淀粉酶發酵工業新備選菌株的開發應用提供資源，也為進一步克隆獲得產淀粉酶基因的研究奠定基礎。

α-淀粉酶；枯草芽孢桿菌；條件優化；鑒定

α-淀粉酶能分解淀粉為糊精、低聚糖和單糖類[1]，它是最早實現工業化生產并迄今為止用途最廣、產量最大的一類酶制劑品種，占據了工業化酶制劑市場約25%的市場價額，廣泛用于糧食加工、食品工業、釀造、發酵、紡織品工業和醫藥等行業，幾乎完全替代了化合試劑在淀粉工業中的使用[2-3]。如何在自然界中篩選更多更好的產淀粉酶菌株，以及如何提高菌株的產酶性能是受到普遍關注的問題。國外著名公司novozyme及genencor不斷推出新的優良菌株[4]，這勢必對我國酶制劑行業造成一定的壓力，因此開發新的菌株具有十分重要的意義。為此，本研究從浙江省溫州市區16個不同地點采樣篩選解淀粉菌株，獲得了一株高產α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌XW86，初步研究了XW86液體發酵的產酶特性和分類鑒定， 為豐富產淀粉酶菌種資源和進一步挖掘該菌株的應用價值奠定基礎。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 樣品：采自浙江省溫州市米店、面粉廠、面粉店、食堂洗米點、食堂面粉儲備庫附近等16處富含淀粉質的土壤和表面積垢共28份。固體標本每份約25 g，裝入無菌培養皿中。表面積垢用無菌棉簽擦拭后投入含玻璃珠9 mL無菌水管中，作為原液。均要立即送檢，當天處理完畢。

1.1.2 培養基：LB淀粉平板[5]和LB淀粉液體培養基（蛋白胨1%；牛肉膏0.3%；NaCl 0.5%；可溶性淀粉 0.2%）[6]。

1.1.3 主要試劑：細菌總DNA提取試劑盒（艾思進）；PCR反應體系所需試劑均為上海生工產品；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米淀粉購自北京雙旋微生物培養基制品廠等。

1.2方法

1.2.1 菌株的分離和初篩：將土壤樣品10 g放入帶有玻璃珠100 mL無菌水的三角瓶中，搖床200 r/min，15 min，懸液記做10-1土壤稀釋液。吸取10-1的土壤稀釋液1.0 mL加入到9 mL的無菌水中，吹吸數次混勻即為10-2稀釋液。依次稀釋制成10-3、10-4、10-5的稀釋液。擦拭液稀釋成10-1、10-2、10-3三個稀釋度。各取三個不同稀釋度固體和擦拭液樣本100μL分別涂布在LB固體平板上，培養后獲取單個菌落。挑取不同菌落特征的克隆，平行轉接到選擇性培養基上，利用碘染色逐日觀察淀粉的降解動態，連續5 d選擇有酶活的菌株并編號保存[7]。

1.2.2 復篩菌株的酶活測定實驗：用碘-淀粉二點比色法篩選獲得的部分菌株再用DNS法進行淀粉酶活測定，記錄吸光度數據，探索酶活變化規律。同時每日傳代被選菌株40 d，測定其傳代后酶活的穩定性。①碘-淀粉二點比色法[8-9]：取37 ℃新鮮培養一定時間的菌懸液1 mL，8000 r/min離心5 min，取上清液即為粗酶液。0.5 mL粗酶液加入9.5 mL的蒸餾水，此稀釋液為測定樣本。測定波長為660 nm，蒸餾水調零，讀取吸光度。酶活單位定義：100 mL樣本，在37 ℃，15 min水解淀粉酶5 mg為一個酶活力單位。計算公式為BV=（OD0-OD1）/OD0×S×N×100/0.2=（OD0-OD1）/OD0×0.4/5×15/7.5×100/0.2=（OD0-OD1）/OD0×80×N，式中：BV為酶活單位；S=反應系統中的淀粉量（mg）；N=酶液稀釋倍數；OD0=空白對照讀數；OD1=樣品管的光密度讀數。100為100 mL的量，0.2 mL為酶液取樣量。②DNS法[10]：用碘-淀粉二點比色法篩選后的部分標本再用DNS進一步測定其酶活性，篩選出高酶活菌株。標本本實驗設定40 ℃時在5 min內水解淀粉釋放1 mg麥芽糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。計算酶活力的公式為:酶活力單位=C酶×V酶×n。式中C酶為酶液中麥芽糖的濃度；V酶為提取酶液的總體積；n為酶液的稀釋倍數。利用麥芽糖梯度標準液繪制標準曲線，用SPSS 12.0統計軟件包計算回歸方程，求出相關系數和標準誤。

1.2.3 細菌種屬鑒定：①傳統形態和生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》，通過革蘭氏染色，形態觀察，選擇芽孢桿菌鑒定試條（法國生物梅里埃VITEK），通過自動化系統生理生化譜分析作出鑒定結果[11-12]。②16S rDNA的PCR擴增和序列分析[13]：采用AxyPrep細菌基因組DNA小量試劑盒提取菌株基因組DNA。根據不同種屬細菌的16S rDNA序列兩端的保守性設計通用引物。正引物F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反引物R：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。利用PCR特異性擴增16S rDNA序列，PCR反應條件為：94 ℃預變熱5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環33次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下出現1.5 kb左右的單一明亮的條帶，證明已擴增到目的序列，產物送交上海鼎安生物技術有限公司測序。測序得到的16S rDNA基因序列應用ClustalW軟件對目的序列進行多序列比對，然后采用MEGA4.0軟件中的鄰位相算法（NJ法）和bootstrap 1000次，構建XW86的16S rDNA基因系統進化樹，最終確定菌株的進化地位。

1.2.4 菌株液體發酵條件的優化：①單因素選擇實驗：分別以不同氮源、碳源、表面活性劑、溫度、pH、金屬離子對產酶的影響進行選擇。②發酵條件的優化、正交試驗[14-15]：根據單因素選擇實驗結果，選擇三因素三水平進行正交實驗和多因素交互作用試驗，運用統計學方法計算平均值和極差決定酶活最佳條件組合，最后確定酶活最佳條件。

1.2.5 液體發酵條件優化前后酶活的比較：同時測定最佳條件下與基礎培養基常規條件的菌株發酵液酶活單位，分別得出其最高酶活，重復三次，計算酶活提高率。

2 結果

2.1 菌株的分離和初篩方法 樣品經稀釋后挑取不同菌落特征的克隆，共篩選出330個菌株。利用平板碘染色逐日觀察淀粉的降解動態5 d，共收集有酶活的菌株86株。

2.2 復篩和菌株的酶活穩定性測定結果 用碘-淀粉二點比色法從86株初篩菌株中篩選出較高酶活菌株20株。再用DNS進行淀粉酶活性測定，回歸方程為Y=0.013X-0.081，r=0.9991186，標準誤為0.16。用配對t檢驗對兩種方法進行比較，結果顯示差異有統計學意義（P＜0.05）。最終我們確定2株酶活性較高的菌株（命名XW82號、XW86號）。將酶活較高的兩菌株同步傳代40代并逐代進行酶活測定，結果發現XW82號菌株續傳32代后酶活大幅下降，酶活力低于100 U/dL（DNS法），XW86號菌株續傳40代仍保持高酶活。

2.3 菌圈比與酶活 我們選擇20株有酶活的菌株測定它第3天的菌圈大小和粗酶液的酶活（DNS法）比探討它們的相關性。數據進行線性回歸分析，結果R2=0.441，P=0.001。

2.4 細菌種屬鑒定

2.4.1 傳統形態和生理生化鑒定：將XW86原始菌株在LB淀粉固體培養基上分區劃線培養獲取單個菌落，24 h后菌落直徑可達4～6 mm，乳白色，不透明，邊緣不整齊，迎光觀察呈白蠟狀。各菌落沿劃線蔓延呈長線片狀。革蘭染色油鏡觀察為革蘭陽性，菌體粗大，長桿狀，可見橢圓形芽胞位于菌體中間和次極端，呈長鏈狀排列。生化鑒定由VITEK系統自動分析和儲存BAC試條鑒定，生化反應結果符合Bacillus subtilis。

2.4.216 S rDNA的PCR擴增和序列分析：從16S rDNA PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖可看出PCR得到的擴增產物約為1.5 kb，符合16S rDNA片斷大小。由上海鼎安生物技術有限公司序列測定得16S rDNA序列為1461 bp，見圖1。將序列上傳到Genebank，申請登錄號為（Accession No.GU248527）。將測序得到的16S rDNA基因序列應用ClustalW軟件對目的序列進行多序列比對，然后采用MEGA4.0軟件中的鄰位相算法（N-J法）和bootstrap 1000次，構建XW86 16S rDNA基因系統進化樹確定XW86進化地位，見圖2。可以看出菌株XW86與Bacillus subtilis聚為一類，同源性達99%以上，與strain QD517的親緣關系最近。

圖1 XW86 16S rDNA PCR產物電泳圖

圖2 XW86菌株16S rDNA序列系統發育樹

2.5 菌株液體發酵條件的優化

2.5.1 單因素選擇實驗：氮源中1%黃豆粉對XW86產酶最有利，1%尿素也有一定作用；碳源2%淀粉量對產酶最好，麩皮也有較好的表現，玉米漿也有利于產酶但相對不明顯；培養基初始pH 6.5時產酶效果較好；發酵培養溫度35 ℃時酶活性較高，溫度升高酶活有所下降；基礎培養基中加0.75%吐溫-80對XW86菌株酶活明顯有促進作用。產酶時間XW86酶活在3～5 d達高峰，6 d后酶活逐漸回落。

2.5.2 發酵條件的優化、正交試驗：根據單因素試驗的結果，各因素對產酶的影響次序為吐溫＞溫度＞鈣離子＞可溶性淀粉＞尿素＞pH。然后選擇三因素三水平正交實驗分析，組合見表1。結果各因素交互作用并不明顯，數據差異無統計學意義。通過27組合均值和極差直觀分析研究，以A3B1C2為最佳組合，即培養基為含0.75%吐溫，0.5%淀粉LB發酵液，初始pH 6.5，35 ℃培養時間120 h。液體發酵優化前后酶活比較試驗也證實了這一點。

表1 L8（26）正交表

2.5.3 液體發酵條件優化前后酶活的比較：各條件因素優化組合的液體發酵粗酶液酶活可高達2200 U/dL（DNS法），比優化前提高2.8倍。

3 討論

3.1 使用傳統鑒定方法結合分子生物學技術鑒定細菌 16S rDNA存在于所有的原核生物，具有高度的保守性，是細菌分類學研究中最常用、最有用的分子鐘，素有“細菌化石”之稱。依據細菌分類學家普遍認可的原則：16S rDNA全序列同源性大于97%為屬內同一種，當小于93%～95%為屬外成員。從16S rDNA基因序列相似性和系統發育樹上可以看出，XW86與Bacillus subtilisQD517 16S rDNA存在99%的同源性，最終確定XW86為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與其相應的形態特征、生理生化特征相吻合。

3.2 發酵條件的優化與正交試驗 根據L8（26）正交實驗結果分析，各因素交互作用不明顯，數據差異無統計學意義。各因素對XW86可能不是絕對優勢因素，只占部分影響。各條件因素的優化組合液體發酵粗酶液酶活可高達2200 U/dL，比優化前提高2.8倍，表明產酶因素的最佳組合對其產淀粉酶活性有很大的優化空間。

3.3 兩種測定酶活方法相結合使復篩過程既快速又準確 碘-淀粉二點比色法，顯色不穩定，線性差，但操作簡單省時，適合大批量標本的快速檢測。DNS法雖操作繁瑣但顯色穩定，線性好。故兩種方法相結合測定酶活更為合理。

3.4 菌圈比與酶活的關系 我們選擇20株有酶活的菌株測定它第3天的菌圈大小和粗酶液的酶活比（DNS法）探討它們的相關性。數據進行了線性回歸分析，結果發現兩者相關性很低，說明菌圈比只能作為酶活高低的參考指標，而不是確切指標。

隨著分子生物學的飛速發展，α-淀粉酶的研究也深入到分子水平，主要包括基因的克隆和異源表達系統的構建、基因表達調控的研究、基因的體外誘變以及結構和功能的關系等。我們也即將展開菌株淀粉酶的克隆與重組等分子生物學研究。

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Screening and identification of a wildBacillus subtiliswith high amylase activity and optimization of its enzyme-producing conditions

CHEN Xiangda*，DAI Huihui，LIU Yan，LI

Yuanyuan， WENG Congcong， RU Bo，ZENG Aibing.
*Renji College， Wenzhou Medical College，Wenzhou， 325035

Objective:To screen a bacterial strain of α-amylase-producing，to study its highyielding fermentation characteristics and its identification and lay the foundation for enriching the resources of α-amylase producing and lapping further the applied value of this strain.Methods:Normal culture and isolation were performed to isolate the strains. The amylase activity was analyzed via screening and re-screening. The strains were identified according to the traditional morphological，physiological and biochemical character-istics as well as 16S rDNA sequence similarity analysis against the genes of retraived form Genbank. The single-factor and orthogonal experiments were performed to determine the optimal conditions for enzymatic production.Results:On the basis of the physiological and biochemical characteristics as well as 16Sr DNA sequence analysis， the isolate was identified as a species ofBacillus subtilisand named XW86. It had the closet relationship with the previously reportedBacillus subtilis（Bacillus subtilisstrain QD517），and their 16S rDNA sequence similarity reached upto 99%. The optimal enzyme-producing conditions for XW86 were as follows: LB medium with 0.5% starch and 0.75% Tween-80， initial pH 6.5，incubation at 35 ℃ for 120 h. The crude extract enzymatic activity from liquid fermentation could reach as high as 2200 U/dL，and it increased 2.8 times compared with that before optimization.Conclusion:XW86 strain is preliminarily identified asBacillus subtilis. Under the optimal growth conditions，the amylase-producing activity is greatly increased. The further improvement of the wild-type strain may provide the resources for an alternative in amylase fermentation industry.

α-amylase；Bacillus subtilis；optimal growth conditions；identification

Q939

A

1000-2138 （2011）01-0040-05

2010-04-12

陳相達（1986-），男，浙江永嘉人，本科生。

曾愛兵，高級實驗師，Email：zab5@163.com。

丁敏嬌）

·論 著·