吉林地區(qū)HFRS病原體基因型分析

趙臣，趙陽(yáng)，李艷，袁忠海，孫可歆，張磊，羅恩杰

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)系，吉林吉林132013;2.中國(guó)人民解放軍第二二二醫(yī)院傳染科，吉林吉林132012;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001)

腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由漢坦病毒(hantavirus，HV)感染引起的一種自然疫源性傳染病［1］。HV屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，病毒基因組有大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)片段組成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30個(gè)血清型，分布在世界各地。其中，引起HFRS的主要為漢灘病毒(HTNV)、漢城病毒(SEOV)、普馬拉病毒(PUUV)和多布拉伐-貝爾格萊德病毒(DOBV)，我國(guó)的HFRS主要是HTNV和SEOV為主引起。吉林省是HFRS的老疫區(qū)和重疫區(qū)，累計(jì)發(fā)病近4萬(wàn)例［2］。吉林市及所屬各縣市是吉林省HFRS的重疫區(qū)，近年來(lái)，吉林地區(qū)HFRS發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。1998年，吉林地區(qū)磐石市曾發(fā)生家鼠型HFRS小規(guī)模流行，2005～2006年再次出現(xiàn)家鼠型HFRS爆發(fā)流行［2-3］。以往報(bào)道中，吉林地區(qū)HFRS病原體主要以HTNV和SEOV為主，但近年來(lái)，不斷有漢坦病毒發(fā)生變異的報(bào)道［4-5］，尤其是2003年以來(lái)，吉林省撫松地區(qū)發(fā)現(xiàn)HV亞型PUUV的流行［6-7］(該病毒于2007年在瑞典引起了大范圍的暴發(fā)流行［8］)，為驗(yàn)證在吉林地區(qū)是否同樣存在PUUV，從而使HFRS發(fā)病率上升、臨床表現(xiàn)有所改變，有必要針對(duì)吉林地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)臨床確診的HFRS病人進(jìn)行系統(tǒng)的研究，明確流行于吉林地區(qū)的漢坦病毒流行株的型別，為制訂有針對(duì)性的防治策略以及為新型疫苗的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2009秋冬至2010年冬春季，在吉林市船營(yíng)區(qū)、豐滿區(qū)、龍?zhí)秴^(qū)、昌邑區(qū)、磐石市、蛟河市、樺甸市、永吉市、舒蘭市捕捉褐家鼠，取鼠肺組織，冰凍切片后用IFA檢測(cè)，漢坦病毒抗原陽(yáng)性的標(biāo)本用于RT-PCR擴(kuò)增。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本中病毒抗原的檢測(cè)鼠肺組織進(jìn)行常規(guī)冰凍切片，用冷丙酮于4℃固定30 min后，用HFRS病人恢復(fù)期血清作為第一抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗人IgG作為第二抗體(Sigma公司)進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒抗原。其中，陽(yáng)性對(duì)照為用普馬拉病毒K27株感染的Vero E6細(xì)胞做的抗原片，陰性對(duì)照為用正常Vero E6細(xì)胞做的抗原片。

1.2.2 病毒RNA提取參照GIBCO公司的Trizol RNA提取試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后加入DEPC水40 μL溶解，-70℃保存。

1.2.3 巢式RT-PCR及PCR產(chǎn)物的純化和回收

使用SuperscripTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶和漢坦病毒屬特異引物P14，按說(shuō)明書(shū)合成cDNA。參照已發(fā)表的HV引物設(shè)計(jì)HTNV、SEOV、PUUV S片段通用外引物和分型引物，設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。常規(guī)進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。切下特異分子量條帶，用回收試劑盒純化回收，純化后的PCR產(chǎn)物，再次PCR檢測(cè)。循環(huán)參數(shù)為94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物溶于20 μL去離子水中，-20℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定和分析從GenBank中選擇漢坦病毒各型代表株序列，應(yīng)用Clustal W方法進(jìn)行序列比較繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用MEGA 3.1軟件進(jìn)行序列比較分析，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。使用DNASTAR軟件包進(jìn)行序列同源性分析。

表1 巢式RT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer of Nested RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 宿主動(dòng)物調(diào)查及病原檢測(cè)結(jié)果

本研究共捕獲各種鼠類共102只(吉林市區(qū)60只，吉林市所屬各縣市區(qū)42只)，IFA檢測(cè)HV陽(yáng)性鼠共4只(均為褐家鼠)，總陽(yáng)性率為3.92%。其中吉林市船營(yíng)區(qū)陽(yáng)性鼠1只，陽(yáng)性率為1.67%;吉林市所屬磐石市陽(yáng)性鼠2只，陽(yáng)性率為4.76%;舒蘭市陽(yáng)性鼠1只，陽(yáng)性率為2.38%。

2.2 漢坦病毒的分型結(jié)果

經(jīng)HTNV、SEOV、PUUV特異性引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，4份HV抗原陽(yáng)性鼠肺組織標(biāo)本均為SEOV型，擴(kuò)增產(chǎn)物398 nt(見(jiàn)圖1)。其中吉林市船營(yíng)區(qū)1份(編號(hào)JL001);吉林市所屬磐石市2份(編號(hào)JL002、JL003);舒蘭市1份(編號(hào)JL004)。

圖1 漢坦病毒分型檢測(cè)結(jié)果Fig.1 RT-nested PCR products of Seoul virus

2.3 SEOV S基因片段核苷酸序列的同源性和進(jìn)化分析

從4份陽(yáng)性標(biāo)本中共擴(kuò)增出4份S片段的核苷酸序列。同源性分析發(fā)現(xiàn)，4份S基因片段核苷酸序列之間的同源性為98.5%～100%，與Panshi Rn74、Shuangyang Rn193、heilongjiang zy27、heilongjiang Pf26等S3亞型病毒株的同源性最高，為95.2%～99.8%;與S1亞型之間的同源性為91.8%～94.6%;與從黑線姬鼠分離到的標(biāo)準(zhǔn)株76～118的同源性為61.3%～68.9%。用部分S基因片段核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，見(jiàn)圖2。由圖2可知，吉林市船營(yíng)區(qū)1只褐家鼠所攜帶病毒(JL001)與heilongjiang zy27株親緣關(guān)系最近;吉林市所屬磐石市2只褐家鼠所攜帶病毒(JL002、JL003)與Panshi Rn74及Shuangyang Rn193株親緣關(guān)系最近;吉林市所屬舒蘭市1只褐家鼠所攜帶病毒(JL004)與heilongjiang Pf26株親緣關(guān)系最近。且4株病毒均在同一分支，同屬于S3亞型。

圖2 SEOV S基因片段核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of S segment of Seoul viruse

3 討論

HV引起人類的HFRS，其病原體是HTNV、SEOV、DOBV和PUUV［3］。我國(guó)歷來(lái)以SEOV、HTNV為主，但是近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)SEOV、HTNV的變異株，2003年在吉林省撫松地區(qū)又發(fā)現(xiàn)了PUUV，加之HFRS病人臨床癥狀愈發(fā)“不典型”化，表明現(xiàn)階段我國(guó)HFRS病原體已經(jīng)出現(xiàn)了新的變化。

在本研究中，在吉林市所屬各縣市區(qū)102只褐家鼠中發(fā)現(xiàn)HV陽(yáng)性鼠共4只，用SEOV特異引物以巢式RT-PCR在4份褐家鼠標(biāo)本中擴(kuò)增到目的片段，但用HTNV及PUUV的特異引物沒(méi)有擴(kuò)增到目的片段。擴(kuò)增出的SEOV S基因片段與HTNV 76-118標(biāo)準(zhǔn)株的同源性低于75%。因此，在吉林市地區(qū)褐家鼠中流行的病毒為SEOV，與鄢燕貞等［9］的研究結(jié)果一致。

本研究中，4份SEOV S基因片段與S3亞型病毒株的同源性高于95%，與S1、S2、S4、S5亞型的漢城型漢坦病毒的同源性低于95%。在用S基因片段核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中，吉林市地區(qū)褐家鼠攜帶的4份SEOV與已知的遼寧省、黑龍江省及吉林省已確定的HV毒株同在S3亞型分支上。因此，吉林市地區(qū)褐家鼠攜帶的漢城型漢坦病毒為S3亞型，也呈現(xiàn)出HV分布的地理聚集現(xiàn)象［10］。

本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)吉林市地區(qū)有PUUV存在，可能存在3個(gè)原因：一是吉林市地區(qū)沒(méi)有PUUV病毒流行分布;二是由于取材范圍小，樣本少，沒(méi)有檢測(cè)到陽(yáng)性鼠;三是PUUV的宿主一般為棕背鼠平，褐家鼠體內(nèi)沒(méi)有PUUV存在，因此檢測(cè)呈陰性結(jié)果。

總之，本研究表明吉林市地區(qū)褐家鼠中流行的病毒為SEOV，為S3亞型。但由于HV的地理分布特點(diǎn)和宿主特異性等原因，會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)誤差，因此上述研究結(jié)果還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)，在今后的研究中還將做進(jìn)一步探討。

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