454測序技術在微生物生態學研究中的應用

段曌，肖煒，王永霞，賴泳紅，崔曉龍

(云南大學云南省微生物研究所，云南昆明650091)

微生物生態學是研究微生物與其周圍的生物及非生物環境的相互作用規律的學科。傳統的微生物生態學研究是基于微生物的直接培養來分析環境中微生物的種群結構及其生態關系的，微生物純培養及顯微技術作為鑒定微生物種群的手段有很大的局限性，因為環境中大多數微生物處于“存活但不能培養”(viable but nonculturable，VBNC)的狀態［1］。因此，不依賴于微生物純培養的分子生物學方法正被廣泛地用于微生物生態學研究，即微生物分子生態學。20世紀90年代以來，微生物分子生態學技術層出不窮，大大加速了微生物生態學的發展。近年來，第2代測序技術的出現使得微生物生態學的研究更加深入和便捷。以Sanger法(雙脫氧核苷酸末端終止法)為代表的第1代測序技術幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組的大量測序工作，但由于其成本高、速度慢、通量低等不足，已不能滿足后基因組時代的測序要求［2］。因此，第2代測序技術應運而生。第2代測序技術主要包括454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺［3］。目前，在微生物生態學研究中應用最廣泛的是GS FLX測序平臺。這種高通量低成本的測序方法為環境微生物多樣性研究提供了新的手段，大大推動了環境基因組研究的快速發展，使得大規模的環境基因組研究相繼展開，大量的新的微生物種群和新的基因得以發現。應用454測序技術的研究論文每月數以百計地發表，本文結合本實驗室的研究成果，對近年來運用454測序技術在微生物生態學研究中的進展進行綜述，并對其研究前景進行介紹。

1 454測序技術原理

GS FLX系統的測序流程概括起來就是“1個片段=1個磁珠=1條讀長(One fragment=One bead=One read)”。特別設計的DNA捕獲磁珠與獨特的短的DNA片段結合，并被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含1個磁珠和1個獨特片段的微反應器。每個獨特的片段在自己的微反應器里進行獨立的擴增。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段仍然結合在磁珠上。攜帶短的PCR產物片段的捕獲磁珠隨后放入只能容納1個磁珠的PTP板中進行測序。放置在4個單獨的試劑瓶里的4種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入1個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放1個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下，釋放出光信號，并實時地被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有1個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號，由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。GS FLX系統在10 h的運行當中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4～6億個堿基信息。除GS FLX系統提供的生物信息學工具外，目前也有很多程序包和數據庫可用于大規模測序數據的分析，如CAMERA［4］、Mothur［5］、FastUnifac［6］等。

2 454測序技術在環境微生物多樣性研究中的應用

454測序技術適于對短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與Sanger測序法相媲美，而速度和數據量卻大大提高，無需文庫構建，沒有克隆的誤差，能最大程度地節約人力、物力。目前，該技術在土壤、海洋、活性污泥、廢水、食品、化妝品、礦井和鹽湖等環境微生物多樣性研究中都有應用。

2.1 454測序技術在土壤微生物多樣性研究中的應用

土壤由固體、液體和氣體3類物質組成，土壤微生物一般包括細菌、真菌、藻類、原生動物、病毒及類病毒。土壤微生物種類和數量隨成土環境及土層深度的不同而變化。Roesch等［7］利用454技術研究了位于西半球一個橫斷面的4類土壤中微生物的多樣性，結果顯示，這4類土壤中，最豐富的微生物類群是擬桿菌門(Bacteroidetes)、α-變形菌門和β-變形菌門。與農業土壤相比，森林土壤的微生物多樣性更為豐富，然而森林土壤中的古菌多樣性較少。此研究證實，是否采取農業化管理對于土壤中古菌和細菌多樣性的影響是顯著的。這一結論也得到了Campbell等的證實。Campbell［8］的研究表明，長期施肥的北極凍土帶土壤微生物不僅多樣性較低，而且被其利用的營養物質也會發生變化，這與土壤中所含碳氮的可利用性以及表層植物的變化有關。除了應用于原核生物的研究，Lim等［9］也應用454技術研究韓國黃海3個島嶼的土壤真菌多樣性。他們不僅發現此前未知的土壤真菌豐富的多樣性，還證明454測序技術也適于土壤真菌多樣性的研究。同樣，454測序技術在功能微生物的研究中也表現出巨大的應用價值。例如研究含高CO2土壤里微生物群落的結構及功能［10］以及農用土壤里氨單加氧酶基因(amoA)豐度［11］。這些研究更深刻地揭示了功能微生物在土壤生態系統中的重要作用。由此可見，應用454測序技術對土壤微生物的研究大大擴展了對土壤微生物多樣性的認識，大量未知的微生物及其在土壤中的功能得以了解，周圍土壤環境對微生物的影響作用得以證實，隨著454技術的發展，該技術在土壤微生物多樣性研究中將會起到越來越重要的作用。

2.2 454測序技術在海洋微生物多樣性研究中的應用

海洋堪稱為地球上最龐大的恒化器，能承受巨大的沖擊(如污染)而仍保持其生命力和生產力，而微生物是其中不可缺少的活躍因素。盡管海洋中存在著豐富的微生物，但是研究手段的限制成為當代海洋微生物學研究和海洋資源開發的障礙。所以，近幾年，許多科學家開始采用高通量測序法來研究海洋微生物。Sogin等［12］檢測深海和未探索的稀有生物圈(rare biosphere)，即位于大西洋東部海山中軸熱泉中的微生物多樣性。454測序結果顯示，大西洋海底和熱泉中的微生物比以前報道的數量要高1～2個數量級，并且微生物類群也比以前報道的要復雜得多。此未探索的稀有生物圈中的微生物是非常古老的，它們不僅可以提供新的基因組數據，在地球歷史的不同時期，還對地球的演變進程產生過深刻的影響。Hube等［13］研究兩鄰近深海熱泉中微生物多樣性和種群結構，檢測到了許多細菌新類群，結果表明，這2眼熱泉微生物種群結構的不同與當地的地理情況相關。由此說明獲取成千上萬條序列是有必要的，這將極大地促進海洋微生物資源的開發。作為海洋生態系統的重要組分，珊瑚的健康向來受到研究者的關注。Gaidos等［14］采用454測序法，研究夏威夷島深海珊瑚礁微生物的群落空間結構及其多樣性，發現最豐富的細菌類群是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門，最豐富的古菌類群是亞硝化侏儒菌目(Nitrosopumilales)、廣古菌門(Euryarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)。針對珊瑚礁與微生物之間的關系，Elizabeth［15］研究位于萊恩群島北部的4個環狀珊瑚礁島的微生物多樣性，分析微生物對珊瑚礁的影響作用。發現微生物對珊瑚礁的生態系統功能具有顯著影響，是維持珊瑚健康生長的一個重要因素。

Dos Santos等［16］為研究石油對紅樹林沉積物中微生物多樣性的影響作用，模擬石油泄漏，污染紅樹林沉淀物，然后進行454測序。結果顯示，污染前后相比，污染后的紅樹林沉積物中微生物類群明顯較多，而γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)都廣泛存在。污染后的紅樹林沉積物中，Chromatiales和Haliea的數量減少2%～5%，海桿菌屬(Marinobacter)、海細菌屬(Marinobacterium)和解環菌屬(Cycloclasticus)的數量增多，該結果暗示，這些微生物都可以作為石油污染的生物監測指標。

除了原核生物，海洋中還含有數量巨大，多種多樣的病毒。Angly［17］對從4大洋的68個樣點采集到的樣品進行454測序，分析得到了184個病毒群，這些病毒是典型的海洋病毒系，具有豐富的多樣性，與現有數據庫中的病毒序列并不相似。病毒總體的多樣性非常高，大概有成百上千個物種，而且區域豐度隨著南北緯度而變化。

海洋微生物資源是一個十分巨大的有待深入開發的資源庫，采用高通量深度測序將提供更多的海洋微生物信息，這些信息在第2代測序技術出現前是很難獲得的，這為今后的海洋資源開發和持續利用奠定良好的基礎。

2.3 454測序技術在沼氣發酵和活性污泥微生物研究中的應用

沼氣是可再生的清潔能源，既可替代秸稈、薪柴等傳統生物質能源，也可替代煤炭等商品能源，而且能源效率明顯高于秸稈、薪柴、煤炭等。早在18世紀科學家們就開始研究沼氣了，對于發酵沼氣的微生物研究也越來越多。Jaenicke等［18］采用第2代454測序系統分析沼氣發酵罐中微生物的多樣性，檢測出之前未出現的Streptococcus(鏈球菌屬)、Acetivibrio(醋弧菌屬)、Garciella、Tissierella(泰氏菌屬)和Gelria，它們在發酵罐中對于沼氣的形成起著重要作用。與之前采用第1代454測序系統研究沼氣發酵罐中微生物的多樣性結果相比，采用新1代454測序技術可以獲得更多的微生物組成信息。由于454測序技術的驚人發展速度，同樣的樣品進行多次分析，可以提供更為豐富的結果。

活性污泥(active sludge)是微生物群體及它們所依附的有機物質和無機物質的總稱。Sanapareddy［19］對廢水處理廠的活性污泥提取的總DNA進行454測序，這些序列只有0.3%組裝成有意義的重疊群。猜測其中117個大于500 bp的重疊群可能為轉座酶和蛋白。通過將所得的序列與已知微生物基因組進行比較，得知污水處理廠中的絕大多數微生物與先前描述的分類單元親緣關系較遠。Kwon等［20］運用同樣的測序技術研究污水的懸浮樣本和IFAS system(Integrated fixed-film activated sludge system，集成固定膜活性污泥體系)膜上的微生物組成和多樣性。比較發現，懸浮樣本中最豐富的微生物類群是β-變形菌綱、γ-變形菌綱、擬桿菌門等，而FAS system膜上樣本中最豐富的微生物類群是放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等，系統發育表明樣本中微生物大都為稀有物種。這些研究中獲得的信息將為以后關于活性污泥微生物群落結構的研究以及對IFAS系統功能的了解奠定基礎。

2.4 454測序技術在食品和化妝品微生物中的應用

隨著454測序技術的成熟，該技術的運用范圍越來越廣。Li等［21］采用454測序技術研究中國傳統酒發酵過程中的細菌與真菌的多樣性。檢測到的細菌分屬于15個科，多于91%的16S rRNA基因序列歸屬于乳酸桿菌科;真菌分屬于6個科，60%的真菌ITS1(Internal transcribed spacer region 1)序列歸屬于酵母科。Lopez-Velasco等［22］采用454測序技術，研究菠菜在冷藏前后所含微生物的變化。得知菠菜冷藏后包含了許多與冷藏前不同的微生物類群，冷藏后微生物群落的豐富性、多樣性、均一度都降低。Telias［23］采用2種不同的水資源，即地下水和地表水，灌溉西紅柿研究其表面微生物的多樣性。454結果顯示，與地表水相比，地下水中細菌的多樣性更為豐富，采用這2種水資源對西紅柿噴灑灌溉不會對西紅柿表面細菌群落組成產生影響，即西紅柿表面細菌群落組成無差異。目前，隨著454測序技術的不斷完善，以其強大的信息量作為優勢，與日常生活息息相關的各類食品開始被嘗試采用此技術對其所含微生物進行檢測。Maiuta等［24］運用454測序技術研究化妝品制劑碳酸鈣中微生物多樣性。結果表明，化妝品制劑碳酸鈣中不存在金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、大腸埃希菌(Escherichia coli)。此研究不僅可以用于確定化妝品制劑碳酸鈣中微生物的多樣性，還明確了化妝品或原材料中指示微生物的存在。這一研究確保一些潛在的重要微生物在危險評估中不被遺漏，為以后化妝品制劑碳酸鈣中微生物的進一步研究奠定了基礎。

2.5 454測序技術在其他方面的應用

近幾年，454測序技術開始被運用于極端環境微生物的研究，Hollister［25］采用該方法研究La Sal del Rey鹽湖底部沉積物中微生物群落結構。與克隆方法相比，454測序發現了許多新的類群。結合這2種方法，使得實驗結果更具可靠性。此研究不僅證實了微生物群落結構與所在湖泊位置、磷、有機碳濃聚物及pH值有密切關系，而且顯示了運用高通量測序技術研究復雜生態系統的價值。除此之外，Edwards［26］對美國明尼蘇達州Soudan礦井中2個位點的水和沉積物的宏基因組進行分析，此2個位點地理位置鄰近而化學和水文地質差異顯著。454測序結果顯示，2個位點的微生物代謝能力差異顯著，大多數微生物的新陳代謝能力與所在環境的地化條件有關，該礦井中的微生物群落與其他環境中的微生物群落是完全不同的。

科學家們相信，極端微生物是這個星球留給人類獨特的生物資源和極其珍貴的研究材料。開展極端微生物的研究，對于揭示生物圈起源的奧秘，闡明生物多樣性形成的機制，認識生命的極限及其與環境的相互作用的規律等，都具有極為重要的科學意義。454測序技術為極端環境微生物的研究也帶來了極大的便利，使得那些極端環境中的稀有微生物得以被描述，為了解生命極限和微生物適應機制，以及嗜極微生物資源的開發奠定了基礎。

3 結語與展望

到目前為止，大量的研究者應用454測序技術對多種環境樣品的微生物多樣性進行了深入研究，這些研究大大增長了人類對微生物的存在和種類的認識。針對不同的研究對象，454測序技術不僅為研究提供了大量數據，證實研究對象所含微生物具有較高的多樣性，而且還建立了一種研究復雜生態系統里的微生物多樣性方法。云南大學云南省微生物研究所始終致力于極端環境微生物資源的挖掘。目前，結合傳統克隆文庫法和454測序技術深入系統地研究云南多種高鹽環境中微生物的多樣性，發現454測序技術獲得了大量克隆方法無法檢測到的新的細菌類群和古菌類群，而所需的時間縮短到原來的1/3，獲得的數據量是同等經費下采用克隆方法所得數據量的近50倍，建立了應用454測序技術研究極端高鹽環境的方法體系。

截止到2011年9月，羅氏公布了1 400多篇利用Genome Sequencer系統的、經同行評議發表的高水平論文［27］。這些文章中許多發表于Nature、Science、Cell、Genome Research、PNAS等高水平雜志上。研究人員正利用454測序的高準確率和超長序列讀長來迅速獲得高質量DNA序列。這些研究跨越了測序應用的多個方面，包括比較基因組學的從頭測序和重測序;小分子RNA研究;宏基因組測序;轉錄組圖譜分析(包括全轉錄組拼接和表達圖譜);染色體結構和表觀遺傳學;有關稀有變異檢測的超深度測序;研究古老DNA;微生物大規模鑒定、分型和突變的研究等。

多種多樣的應用彰顯出454測序系統應對重要研究領域的能力。但由于該技術剛剛起步因此也存在一些有待改善的問題，如在測定一連串相同核苷酸時容易產生錯誤;由于其依賴于包含一系列酶的焦磷酸檢測，與其他第2代測序技術相比，其試劑價格相對較高。同時，序列讀長較短也是限制該技術應用的原因之一。

雖然存在許多不足，454測序技術仍以其強大的測序能力滲透到生命科學研究的方方面面，包括那些此前無法用測序來解決的領域。在微生物生態學領域，憑借著454測序技術各方面的優勢，終究將成為未來研究環境基因組的主導測序技術，同時，隨著454技術的不斷完善，該技術將為微生物生態學研究注入新的動力，成為微生物生態學研究新的亮點，大大加速微生物生態學的發展，增長人類對微生物生態學的認識，為人類探索廣袤的微生物資源提供無限遐想。

［1］ Oliver JD.The viable but nonculturable state in bacteria［J］.Journal of Microbiology，2005，(43)：93-100.

［2］ Sanger F，Nicklen S，Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors［J］.Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United State of America，1977，74(12)：5463-5467.

［3］ Shendure J，Ji H.Next-generation DNA sequencing［J］.Nature Biotechnology，2008，26(10)：1135-1145.

［4］ http：//camera.calit2.net/.

［5］ http：//www.mothur.org/.

［6］ http：//bmf2.colorado.edu/fastunifrac/index.Psp

［7］ Roesch LF，Fulthorpe RR，Riva A，et al.Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity［J］.The ISME Journal，2007，1(4)：283-290.

［8］ Campbell BJ，Polson SW，Hanson TE，et al.The effect of nutrient deposition on bacterialcommunities in Arctic tundra soil［J］.Environmental Microbiology，2010，12(7)：1842-1854.

［9］ Lim YM，Kim BK，Kim C，et al.Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing［J］.Journal of Microbiology，2010，48(3)：284-289.

［10］ He ZL，Xu MY，Deng Y，et al.Metagenomic analysis reveals a marked divergence in the structure of belowground microbial communities at elevated CO2［J］.Ecology Letters，2010，13(5)：564-575.

［11］ Leininger S，Urich T，Schloter M，et al.Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils［J］.Nature，2006，442(7104)：806-809.

［12］ Sogin ML，Morrison HG，Huber JA，et al.Microbial diversity in the deep sea and the underexplored“rare biosphere”［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America，2008，103(32)：12115-12120.

［13］ Huber JA，Mark Welch DB，Morrison HG，et al.Microbial population structures in the deep marine biosphere［J］.Science，2007，318(5847)：97-100.

［14］ Gaidos E，Rusch A，Ilardo M.Ribosomal tag pyrosequencing of DNA and RNA from benthic coral reef microbiota：community spatial structure，rare members and nitrogen-cycling guilds［J］.Environmental Microbiology，2011，13(5)：1138-1152.

［15］ Dinsdale EA，Pantos O，Smriga S，et al.Microbial ecology of four coral atolls in the northern line islands［J］.PLoS ONE，2008，3(2)：e1584.

［16］ Dos Santos HF，Cury JC，Do Carmo FL，et al.Mangrove bacterial diversity and the impact of oil contamination revealed by pyrosequencing：bacterial proxies for oil pollution［J］.PLoS ONE，2011，6(3)：e16943.

［17］ Angly FE，Felts B，Breitbart M，et al.The marine viromes of four oceanic regions［J］.PLOS BIOLOGY，2006，4：e3681.

［18］ Jaenicke S，Ander C，Bekel T，et al.Comparative and joint analysis of two metagenomic datasets from a biogas fermenter obtained by 454-Pyrosequencing［J］.PLoS ONE，2011，6(1)：e14519.

［19］ Sanapareddy N，Hamp TJ，Gonzalez LC，et al.Molecular diversity of a North Carolina wastewater treatment plant as revealed by pyrosequencing［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(6)：1688-1696.

［20］ Kwon，Soondong，Kim TS，et al.Bacterial community composition and diversity of a Full-Scale Integrated Fixed-Film Activated Sludge System as investigated by Pyrosequencing［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20(12)：1717-1723.

［21］ Li XR，Ma EB，Yan LZ，et al.Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，146(1)：31-37.

［22］ Lopez-Velasco G，Welbaum GE，Boyer RR，et al.Changes in spinach phylloepiphytic bacteria communities following minimal processing and refrigerated storage described using pyrosequencing of 16S rRNA amplicons［J］.Journal of Applied Microbiology，2011，110(5)：1203-1204.

［23］Telias A，White JR，Pahl DM，et al.Bacterial community diversity and variation in spray water sources and the tomato fruit surface［J］.BMC Microbiology，2011，11：81.

［24］ Maiuta N，Schwarzentruber P.Molecular detection of bacteria in calcium carbonate powder used in cosmetic formulations［J］.International Journal of Cosmetic Science，2011.Article first published online：8 MAR 2011 DOI：10.1111/j.1468-2494.2011.00648.x

［25］ Hollister EB，Engledow SA，Hammett AJM，et al.Shifts in microbial community structure along an ecological gradient of hypersaline soils and sediments［J］.The ISME Journal，2010，4：829-838.

［26］ Edwards RA，Rodriguez-Brito B，Wegley L，et al.Using pyrosequencing to shed light on deep mine microbial ecology［J］.BMC Genomics，2006，7：57.

［27］ http：//www.my454.com/.