高效價凍干人用狂犬病疫苗暴露后免疫程序的研究

汝東宇，雷連成

(吉林大學畜牧獸醫學院微生物與免疫學實驗室，吉林長春130000)

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患疾病。根據世界衛生組織的報告，全世界每年死于狂犬病的患者約55 000例，99%的病例發生在發展中國家，其中亞洲約占全球狂犬病發病總數的56%，非洲約占發病總數的44%。其中印度發病人數最多，位居第一，我國次之［1-2］。人用狂犬病疫苗的免疫分為暴露前免疫及暴露后免疫，各國推薦使用的人用狂犬病疫苗免疫程序也不相同［3-4］。世界衛生組織推薦的狂犬病毒暴露前免疫方案為0、7、21或28 d各免疫1劑量的疫苗，疫苗效力不低于2.5 IU/劑。暴露后免疫則有多種方案：埃森法(Essen regimen)，第0、3、7、14和28天各肌肉注射1個劑量的疫苗(2.5 IU)。薩格勒布法(Zagreb regimen，2-1-1)，第0天，分別在左和右上臂肌肉各注射1個劑量的疫苗，此后于第7和21天，各將1個劑量的疫苗注射至上臂，此種程序可免去2次就診和1劑疫苗。泰國紅十字會皮內注射法(Thai Red Cross Schedule“2-2-2-1-1”法)，第0、3、7天，在2個不同的淋巴引流區(通常為左、右上臂)皮內注射1個劑量(0.1 mL)的疫苗，在第30和90天各注射0.1 mL疫苗。8部位皮內注射法(8-0-4-0-1-1)，第0天，在8個不同部位皮內注射1個劑量疫苗(0.1 mL)。第7天，在每側上臂和每側大腿的外側皮內注射4個0.1 mL的疫苗，此后，第28和90天各注射0.1 mL劑量的疫苗。上述各國應用的人用狂犬病疫苗免疫方案均需接種4針次以上疫苗，全程免疫時間為21～90 d。在薩格勒布方案中，雖只接種4針，但在暴露后第3天沒有接種疫苗，而第3天對暴露后傷口的檢查是非常重要的。本文制備了一種高效價的凍干人用狂犬病疫苗，在高效價的基礎上，以減少狂犬病疫苗的免疫針次并縮短全程接種時間，對暴露后免疫程序進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物BALB/c小鼠，雌性，11～13 g;比格犬，5～6 kg(上海交通大學實驗動物中心，經狂犬病毒抗體檢測為陰性)。

1.1.2 病毒和細胞狂犬病街毒株CNX8601(由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供，1986年分離自中國寧夏病人腦組織);狂犬病街毒株BD06(由軍事醫學科學院軍事獸醫研究所流行病學研究室提供);狂犬病病毒株CVS11;BSR細胞(由武漢生物制品研究所基因工程室提供)。

1.1.3 試劑和標準品人用狂犬病毒免疫球蛋白(21.4 IU/mL)，購自中國藥品生物制品檢定所;FITC標記的抗狂犬病毒核蛋白熒光抗體(Chemico);胎牛血清、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、谷氨酰胺、DMEM培養基(GIBCO);丙酮(北京化工廠);依文思藍(Sigma)。

1.1.4 實驗樣品高效價凍干人用狂犬病疫苗(HPRabV)，效價6.0 IU/劑，凍干人用狂犬病疫苗(RabV)，效價3.1 IU/劑。

1.2 方法

1.2.1 以小鼠為試驗動物HPRabV暴露后保護效果評價BALB/c小鼠，11～13 g，隨機分成3組，每組32只;狂犬病街毒株CNX8601，毒力為4.2 LgLD50，病毒采用30 LD50劑量接種于小鼠咬肌，接種病毒后2 h，腹腔免疫0.5 mL實驗用疫苗。HPRabV(6.0 IU/劑)按0、3、14免疫程序免疫，RabV按0、3、7、14、28免疫程序免疫，設病毒對照組。于第5、7、10、14、18、22、26、33、37、44天于眼眶后靜脈采血，分離血清，采用RFFIT法測定血清中的中和抗體效價［5］。對HPRabV和RabV產生的中和抗體進行統計分析。每天觀察小鼠死亡情況，于第4天開始記錄死亡的小鼠，根據病毒對照組死亡率及疫苗組的生存率計算HPRabV和RabV的保護率，并對兩者進行評價。

1.2.2 以比格犬為實驗動物HPRabV暴露后保護效果評價實驗動物為比格犬，體重5～6 kg，隨機分成4組，每組10只，每只均咬肌接種200 000 LD50狂犬病街毒BD06株，前腿肌肉注射HPRabV(效價6.0 IU/劑)或RabV(效價3.1 IU/劑)，并設病毒對照組。免疫程序：①HPRabV于0、3、10 d各接種1劑量的疫苗;②HPRabV于0、3、14 d各接種1劑量的疫苗;③RabV于0、3、7、14、28 d各接種1劑量的疫苗;④病毒對照組。各組分別在5、7、10、14、18、22、26、33、37、44 d用注射器頸部靜脈取血1.0 mL，37℃放置1 h，4℃12 h，5 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，56℃滅活30 min，利用RFFIT法檢測血清中的中和抗體效價。觀察并記錄實驗動物死亡情況，計算疫苗保護率。

2 結果與分析

2.1 小鼠暴露狂犬病街毒后接種HPRabV和RabV產生的中和抗體比較

以小鼠為實驗動物的暴露后免疫保護實驗中和抗體測定結果顯示，HPRabV 0/3/14同RabV 0/3/7/14/28比較，經統計分析，P＜0.05，2組之間相比有顯著性差異，HPRabV 0/3/14產生的中和抗體高于RabV 0/3/7/14/28組。

圖1 小鼠暴露街毒后接種HPRabV和RabV產生的中和抗體檢測結果Fig.1 RVNA responses induced by HPRabV(6.0 IU/dose)and RabV(3.1 IU/dose)in BALB/c post exposure

2.2 小鼠暴露狂犬病街毒后接種HPRabV及RabV的保護率

小鼠咬肌接種狂犬病街毒CNX8601，劑量為30LD50，結果病毒對照組死亡率為93.8%，HPRabV組疫苗保護率為56.2%，RabV組的保護率為40.6%，結果見圖2。

圖2 小鼠暴露狂犬病街毒后接種HPRabV及RabV的保護率Fig.2 Survival rate of BALB/c mice after post-exposure prophylaxis

2.3 以比格犬為實驗動物暴露后免疫中和抗體檢測結果

利用RFFIT法檢測血清中的中和抗體效價，計算各組中和抗體幾何平均效價(IU/mL)，結果見圖3。經統計學分析，HPRabV 0/3/10組、HPRabV 0/3/14組與RabV 0/3/7/14/28組之間分別進行中和抗體水平比較，經t檢驗，P＞0.05，不同免疫程序產生的中和抗體效價均無顯著性差異。免疫后10 d前HPRabV組中和抗體水平明顯高于RabV組。第10天抗體檢測，RabV組為23.8 IU/mL，HPRabV組為29.5 IU/mL和29.0 IU/mL，HPRabV組與RabV組分別進行t檢驗，P＜0.001，有極顯著性差異。同時第5、7天HPRabV組中和抗體水平均高于RabV組。HPRabV能夠更早的刺激機體產生高效價的中和抗體。HPRabV 0/3/10組與HPRabV 0/3/14組間比較，兩者前期(0～18 d)中和抗體幾何平均效價基本持平，而后者在后期(22～56 d)中和抗體幾何平均效價均高于前者。

圖3 比格犬暴露后2種疫苗不同免疫程序產生的抗體效價比較Fig.3 RVNA responses induced by HPRabV and RabV in beagles post exposure prophy laxis

2.4 比格犬暴露狂犬病街毒后疫苗保護率結果

比格犬經200 000 LD50狂犬病毒街毒株BD06攻擊后，2種不同效價疫苗的保護率結果見圖4。由圖4可見，病毒對照組死亡率為100%，表明比格犬街毒暴露后保護率試驗結果成立。街毒攻擊后HPRabV 0/3/10免疫程序死亡3只實驗動物，疫苗保護率為70%;HPRabV 0/3/14免疫程序死亡2只實驗動物，疫苗保護率為80%;RabV 0/3/7/14/28免疫程序死亡3只實驗動物，疫苗保護率為70%。保護率試驗結果表明HPRabV 0/3/10組、HPRabV 0/3/14組與RabV 0/3/7/14/28組街毒攻擊均具有保護作用，HPRabV 0/3/14組疫苗保護率高于其他2組。

圖4 街毒攻擊后2種疫苗不同免疫程序免疫比格犬保護率結果Fig.4 Survival rate of beagles after post-exposure prophylaxis

3 討論

狂犬病疫苗主要應用于暴露后免疫，WHO推薦使用的是埃森法，在0、3、7、14、28 d各免疫1個劑量的人用狂犬病疫苗，疫苗的效力不低于2.5 IU/劑，本研究制備的高效價凍干人用狂犬病疫苗(6.0 IU/劑)目標是使暴露后免疫針次減少到3針，達到和現有疫苗同樣的保護效果。

以小鼠為實驗動物的暴露后免疫保護實驗中和抗體測定結果顯示，HPRabV 0/3/14同RabV 0/3/7/14/28比較，經統計分析，P＜0.05，2組之間相比有顯著性差異，HPRabV 0/3/14產生的中和抗體高于RabV 0/3/7/14/28組。并且2組的最高值均出現在18～22 d，2組產生的中和抗體水平消長情況比較相似，是高效價凍干人用狂犬病疫苗比較理想的免疫程序。

在以比格犬為實驗動物的暴露后免疫程序研究中，以BD06株作為攻擊用毒株，病毒對照組死亡率為100%，表明本次比格犬街毒暴露后保護率試驗結果成立。HPRabV 0/3/10免疫程序疫苗保護率為70%;HPRabV 0/3/14免疫程序疫苗保護率為80%;RabV 0/3/7/14/28免疫程序疫苗保護率為70%。保護率試驗結果表明HPRabV 0/3/10組、HPRabV 0/3/14組與RabV 0/3/7/14/28組街毒攻擊均具有保護作用，HPRabV 0/3/14組疫苗保護率高于其他2組。

［1］ 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗(第2版)［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2009.

［2］ WHO Weekly Epidemiological Record［M］.2007，49/50：425-435.

［3］ Manning SE，Rupprecht CE，Fishbein D，et al.Human rabies prevention-United States，2008：recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices［J］.MMWR Recomm Rep，2008，57(RR03)：1-26，28.

［4］ LeGuerrier P，Pilon PA，Deshaies D，et al.Pre-exposure rabies prophylaxis for the international traveler：a decision analysis［J］.Vaccine，1996，14(2)：167-176.

［5］ F-X Meslin，MM Kaplan，H Koprowski.Laboratory techniques in rabies.4th Edn［M］.World Health Organization publications，1996.