直投式酸奶發酵劑中雙歧桿菌的分離

陳杰，孫翠煥，吳英春，陳麗媛，馮華，徐沖

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000)

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是Tissier博士從母乳喂養嬰兒的糞便中分離得到的一種專性厭氧、無運動性、無芽孢、無鞭毛及莢膜的革蘭陽性桿菌［1］，末端常分叉故名雙歧桿菌［2］，是人和動物腸道的重要生理性有益菌。近年來，雙歧桿菌對人體的健康作用研究越來越多，含有雙歧桿菌的發酵乳制品、腸道微生態制劑等產品已經在相關領域占有一席之地。雙歧桿菌在腸道能合成B族維生素及氨基酸，促進鈣、鐵的吸收;可保持腸道正常微生物菌群平衡，增強機體的非特異性和特異性免疫反應，降低血清膽固醇水平，有防癌抗癌、控制內毒素血癥的作用［3］，其功能越來越受到人們的重視。本文介紹一種簡便的分離方法，針對直投式發酵劑中雙歧桿菌進行菌種分離，從中分離生產性能優良的雙歧桿菌，作為出發菌株，供企業技術人員及科研人員研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料進口直投式酸奶發酵劑，標注為雙歧桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌的混合凍干菌粉。

1.1.2 培養基［4］①WR1培養基(%)：酪蛋白胨1，牛肉膏0.5，酵母膏0.5，葡萄糖0.5，番茄6，丙酸鈉1，Na2S·9H2O 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO4·7H2O 0.01，L-半胱氨酸0.05，刃天青0.000 1，pH 7;②WR2培養基(%)：大豆蛋白胨1，酵母膏1，葡萄糖1，山梨酸0.04，刃天青0.000 1，胡蘿卜汁5，鹽溶液4，L-半胱氨酸0.05，pH 7;③WR3培養基(%)：水解酪蛋白1，牛肉膏0.5，酵母膏0.5，葡萄糖1，LiCl 0.3，K2HPO40.05，KH2PO40.04，番茄汁5，維生素C0.3，L-半胱氨酸0.05，pH7;④酸化MRS培養基，調整pH 5.1;⑤M17培養基;⑥MRS培養基。

1.1.3 儀器設備CO2培養箱，恒溫培養箱，超凈工作臺，顯微鏡，高壓滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 直投式發酵劑的菌種活化無菌條件下取少許菌粉轉入WR1液體培養基中，輕搖使菌粉融解，注意盡量避免空氣進入。分別吸取上述菌液按4%(體積比)接入WR1、WR2、WR3 3種液體培養基中，輕搖使均勻。于CO2培養箱中37℃恒溫培養16 h，CO2濃度為20%。同樣操作，將菌液接入MRS液體培養基中，37℃恒溫有氧培養16 h。鏡檢觀察菌體生長情況。

1.2.2 平板劃線分離雙歧桿菌根據菌種活化結果，在WR1、WR2、WR3中選擇雙歧桿菌生長良好的培養基作為分離用平板培養基，以對應培養液中活化的菌體作出發菌株，進行劃線培養。37℃恒溫培養48～72 h，CO2濃度20%。同樣操作，將MRS中活化的菌體分別在酸化MRS和M17培養基平板劃線，37℃恒溫有氧培養48～72 h。各做3個重復。觀察菌落生長情況。

1.2.3 雙歧桿菌的初步鑒定［1，3，5］①觀察菌落形態及顯微鏡觀察菌體形態;②對菌體進行革蘭染色，雙歧桿菌為革蘭陽性菌;③生長的氣體環境：挑取少許雙歧桿菌于最適培養基平板劃線，分別在CO2濃度為0%、5%、10%、15%、20%條件下37℃恒溫培養48～72 h，各做3個重復，觀察菌落生長情況;④生長溫度試驗：挑取少許雙歧桿菌于最適培養基平板劃線，分別在20、37和46.5℃下培養48～72 h，CO2濃度為20%，各做3個重復，觀察菌落生長情況。

1.2.4 培養液中菌體計數方法吸取1 mL培養液，加無菌水23.5 mL，0.3%亞甲基蘭染液0.5 mL，用血球計數板在顯微鏡下計數。

2 結果與分析

2.1 直投式發酵劑的菌種活化

以WR1、WR2、WR3、MRS液體培養基為活化培養基，結果見表1。

表1 菌體活化情況Table 1 Activation of thallus

由表1可知，WR1、WR2、WR3培養液中均有3種菌生長，MRS培養液中有2種菌生長。從菌體形態可初步認定，菌1為嗜熱鏈球菌。分析菌2和菌3，根據菌體的大小、菌體形態、甲基蘭染色等特性，初步認定菌2為德氏乳桿菌保加利亞亞種，菌3為雙歧桿菌［1，3］。但還要經過生理生化試驗才能做最后結論。本文只對桿菌做進一步研究。菌3在培養基WR1中生長狀況好于其他3種，且綜合考慮菌1和菌2被抑制生長的情況，應選擇WR1做為進一步試驗用培養基。在MRS培養液中，只有菌1和菌2生長，根據經驗，可用酸化MRS和M17培養基的瓊脂平板劃線法分離嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種。

2.2 平板劃線分離雙歧桿菌

依據表1結果，選擇WR1作為平板劃線分離雙歧桿菌的最佳培養基。本試驗可同時分離嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種。各培養基平板上單菌落形態及顯微鏡檢查結果見表2。由表2可知，在WR1平板上的單菌落a的形態與菌體狀態符合對雙歧桿菌的描述［1］。從菌落b和c的描述中，初步確定b為德氏乳桿菌保加利亞亞種，c為嗜熱鏈球菌。但酸化MRS和M17分別是二者的選擇培養基，在其平板上生長的單落更進一步驗證了菌種的可能性。2菌種分別在MRS和M17斜面培養基上培養保存。如有需要，可依據二者的生理生化特點分別進行鑒定。本文在此不再討論。

表2 菌落檢出情況Table 2 Detection of colony

2.3 雙歧桿菌的初步鑒定

2.3.1 菌落形態及菌體形態菌落形態及菌體形態觀察結果見表2，均符合對雙歧桿菌的描述。

2.3.2 其他鑒定項目結果結果見表3。

表3 菌種鑒定情況Table 1 Identification of culture

從表3結果看出，試驗菌在37℃培養，CO2濃度低于5%時不生長，高于10%則隨著CO2濃度增加菌體生長旺盛，屬于厭氧菌。試驗菌在20%CO2濃度下，20℃和46.5℃均不生長，而在37℃生長旺盛。根據生理生化特性，從以上鑒定結果可初步確定，所分離的桿菌為雙歧桿菌。

3 討論

從本次分離試驗中發現，雙歧桿菌的選擇性培養基并沒有完全抑制嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的生長。在查閱的相關資料中也有報道，當雙歧桿菌被其他厭氧菌明顯超過時，雙歧菌的選擇分離問題尚未完全得到解決。在直投式酸奶發酵劑中，嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種2種兼性厭氧菌活力旺盛，可能影響了雙歧桿菌的純菌分離，試驗結果與資料報道相符。另有原因可能是進口直投式酸奶發酵劑中的嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種本身是生產性能優良菌株，對某些抑制劑有抗性，可能會出現上述結果。這些問題將在以后的工作中做深入研究。

［1］ 凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1999.

［2］ 呂志勇，呂志剛.雙歧桿菌的保健功能及其產品研發［J］.安徽農業科學，2006，34(19)：5031-5032.

［3］ 郭本恒編著.益生菌［M］.北京：化學工業出版社，2004.

［4］ 馬鋼.酸奶及其飲料中雙歧桿菌分離培養與計數［J］.食品科學，1994，11(1)：51-52.

［5］ R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊(第8版)［M］.北京：科學出版社，1984.