果膠酶高產菌株的紫外線及硫酸二乙酯的誘變育種

由田，宋剛，凌紅志，葛菁萍

(黑龍江大學生命科學學院微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱150080)

果膠酶是能分解果膠質的一類含多種酶的復合酶，普遍存在于植物果實和微生物中。在自然界中，果膠質廣泛存在于高等植物中，是植物體中一類復雜的膠體性糖類，它是由D半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵形成的直鏈狀聚合物，是植物細胞間的胞間層和初生壁的重要組分，在麻纖維中含量較高。由于果膠質在植物的細胞組織中起著“粘和”作用，一旦植物組織中的果膠質分解便引起細胞的離散［1］。通過果膠酶的作用，可將果膠質降解為小分子物質，從纖維中游離出來，可使與其粘合在一起的其他雜質(如蠟質、蛋白質、灰份等)與纖維素徹底分開，達到麻脫膠的目的［2］。果膠酶產生菌在漚麻過程中的應用可使漚麻周期縮短，提高亞麻纖維的質量及出麻率。誘變育種方法雖然是不定向變異，但誘變結果相對于單純的培養基選育均有較大的突變率。菌種通過合適的誘變，能更好地選育出產酶量更高、酶學性質更穩定、針對性更強的新菌株［3］。目前以輻照誘變和化學誘變較為多見，且效果較好。李延生等［4］使用微波誘變表明，誘變的突變率較大，且最高正突變發生的酶活力都要高出數十個百分點。Hadj-Taieb Noomen［5］采用亞硝酸對青霉菌(Penicillium occitanis)進行誘變，得到1株突變型菌株CT1，該菌株產酶活力遠遠高于原始菌株，并且不需果膠或其他類似物的誘導，降低了生產成本。本文是以黑龍江省巴彥亞麻有限公司漚麻池中分離篩選出的HDYM-02為出發菌株，用紫外線及硫酸二乙酯進行誘變，從大量突變株中進行篩選，最終得到產酶高峰較早及產酶效率高的突變株UV-21和DES-1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種果膠酶產生菌HDYM-02，從黑龍江巴彥亞麻有限公司漚麻池中分離篩選得到，經形態觀察，生理生化特性和16S rDNA序列分析，判定其屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)，由黑龍江大學微生物重點實驗室保存。

1.1.2 培養基試管斜面培養基：牛肉膏蛋白胨培養基;分離培養基：果膠4 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0～7.2，115℃20 min滅菌;發酵培養基：①種子發酵液：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃15 min滅菌;②擴大培養發酵液：果膠粉4 g，蛋白胨10 g，NaCl 15 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0～7.2，115℃20 min滅菌;初篩培養基：上層：果膠0.2%(質量與體積比)、瓊脂粉2%(質量與體積比)，10 mL;下層：牛肉膏蛋白胨培養基20 mL(直徑11 cm的大平板)。

1.1.3 試劑染色劑0.1%(質量與體積比)剛果紅溶液;洗脫液1 mol/L NaCl溶液;DNS試劑。

1.2 方法

1.2.1 菌種的純化將HDYM-02的保藏菌種在平板培養基上進行活化，然后接入種子發酵液，37℃、120 r/min搖床培養24 h，離心洗滌菌體，制備菌懸液，稀釋涂布于分離培養基平板。待菌落長出后，挑單菌落純化。選擇完全純化的菌種作為出發菌株進行誘變育種。

1.2.2 HDYM-01的誘變育種［6-8］①紫外線誘變處理：a.菌懸液的制備：取培養24 h的純化后的斜面，接2環菌至30 mL種子發酵液，37℃、120 r/min搖床培養18 h，3 000 r/min離心20 min，棄上清，用無菌生理鹽水離心洗滌2次，沉淀用生理鹽水調成108cfu/mL的菌懸液;b.紫外線處理過程：先將15 W紫外燈預熱30 min，移4 mL菌懸液至直徑為6 cm的無菌平皿中(內置磁力轉子)置于磁力攪拌器上，距離30 cm，照射時間設為10、15、20、30、40 s;c.誘變后的處理：在紅燈照射下，將照射后的菌液以10倍梯度稀釋法稀釋為10-1～10-7，取3個適當稀釋度菌液涂布于分離培養基中，每只平板加稀釋液0.2 mL，每個稀釋度涂平板3只，以同樣操作取未經紫外照射的平板作對照，用黑布包好，置37℃培養48 h，記錄菌落數并計算致死率。挑取致死率在70～80%的單菌落，中間培養后進行初篩;②硫酸二乙酯誘變處理：a.菌懸液的制備：將HDYM-02接2環菌至30 mL種子發酵液中，37℃、120 r/min搖床培養18 h，3 000 r/min離心20 min，棄上清，用0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液30 mL離心洗滌2次，將沉淀下來的菌體用磷酸緩沖液懸浮稀釋，并將菌懸液調至濃度為107～108cfu/mL;b.硫酸二乙酯處理過程：取菌懸液4 mL加入裝有16 mL的磷酸緩沖液中，再加入硫酸二乙酯0.2 mL，按規定時間(30、60 min)處理，用0.5 mL 25%(質量與體積比)的硫代硫酸鈉溶液中止反應;c.誘變后的處理：中止反應后的菌液用生理鹽水離心洗滌3次，梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，涂布分離培養基平板后培養(與紫外線處理同)。

1.2.3 突變株的篩選①剛果紅染色法初篩［9］：將出發菌株及誘變后的菌株，在牛肉膏蛋白胨培養基上于37℃培養12 h，待菌落長出后，于其上鋪上層初篩培養基，繼續培養6 h，然后用0.1%的剛果紅染色劑染色15 min，傾去染色劑，用1 mol/L NaCl溶液蕩洗平板15 min，靜置待透明圈顯現后，用游標卡尺測量透明圈直徑(H)及菌落直徑(C)，計算H/C值，挑選H/C值大于出發菌株的突變菌株進行復篩(測定酶活);②酶活力測定方法［1，10］：接2環進行復篩的菌株于種子發酵液培養18 h，按3%的接種量接入擴大培養液，分別在培養6、12、24、48、72 h時取出菌液，測定其OD590nm，離心棄沉淀，上清液即為粗酶液。取0.25%(質量與體積比)的果膠溶液(用pH 6.8的磷酸緩沖液配制)1 mL于試管中，加磷酸緩沖液2 mL 50℃水浴中平衡后，加入適當稀釋的酶液1 mL保溫30 min，用DNS法測定水解產生的還原糖。在上述條件下，每分鐘由底物產生1 μmol還原糖(以半乳糖醛酸計)所需的酶量定義為1個酶活單位。

2 結果與分析

2.1 紫外線誘變處理

2.1.1 最佳誘變劑量的確定表1為不同照射時間的誘變效果，隨著照射時間的加長，致死率也在逐漸增加，到40 s時，致死率已接近100%。一般來說，致死率在70%左右時其正變率也較高。由表1可知，紫外線照射10、15 s的致死率均在70%～80%之間。為保證有較高的篩選機率，選擇15 s的UV照射劑量。

表1 不同紫外線照射時間下的致死率Table 1 Lethality from different time of UV irradiation

2.1.2 UV照射后突變株的選育以HDYM-02作為出發菌株，UV照射15 s后，通過剛果紅染色初篩挑選H/C較大的菌株。共獲得7株突變株(圖1)，分別為UV-1、UV-2、UV-3、UV-5、UV-18、UV-19和UV-21，其H/C分別為4.042、3.833、4.313、4.261、4.245、4.138、5.694，均大于對照出發菌株(H/C為3.280)。

圖1 UV誘變的7株突變株的剛果紅染色初篩結果Fig.1 The result of Congo red staining of 7 mutant strains by mutating with UV

對此7株突變株進行酶活測定，復篩結果見圖2。由圖2可知，UV-21在24 h時酶活力為49 U達到產酶高峰期，而此時出發菌株的酶活力僅為31 U，前者是后者的1.6倍。其他突變株的酶活力效果不十分理想，UV-18和UV-5分別在48 h和72 h才到達產酶高峰，其余菌株的產酶高峰均低于出發菌株。

圖27 株突變株的復篩酶活測定結果Fig.2 The pectinase activities of 7 mutant strains

2.2 硫酸二乙酯(DES)誘變處理

以HDYM-02為出發菌株，經DES多次誘變，通過初篩挑選出3株突變株(圖3)，分別為DES-1、DES-2、DES-3，其H/C分別為4.164、4.134、4.263，均大于對照出發菌株(H/C為3.638)。對這3株突變株進行復篩的結果如圖4。

由圖4可知，DES-1在12 h時的酶活力為39 U達到產酶高峰，而此時出發菌株的酶活力為27 U，說明DES-1的產酶期提前，且12 h的酶活力是出發菌株的1.44倍。如果將DES-1投入生產其產酶高峰早可以使漚麻期縮短。

3 討論

本研究采用的紫外線誘變處理方法簡便，效果好，危險性又小，而DES是一種較強的誘變劑，致死率很高，但誘變效果不是很理想，可能是因為野生菌株對誘變劑很敏感，易發生突變，而經多次誘變處理后回復突變就比較明顯［7，11］。對篩選方法即剛果紅染色法的進一步改善，得到了一套實用的誘變及篩選的方案。最終通過誘變和篩選的交替，得到2株HDYM-02的突變株UV-21和DES-1，它們的產酶高峰早且產酶效率高，符合投入生產的需要。

［1］ 王傳槐，葉漢玲，王清.優良堿性果膠酶產生菌選育［J］.南京林業大學學報，1994，18(4)：51-56.

［2］ 顧燕松.紡織生物助劑果膠酶酶活的測定方法［J］.紡織科學研究，2002，(3)：29-35.

［3］ 果膠酶高產菌選育研究進展［J］.農產品加工(創新版)，2009，(12)：53-58.

［4］ 李延生，王平諸，鮑宇茹.果膠酶高產菌株Aspcrgillus niger 3502的選育［J］.鄭州工程學院學報，2001，22(4)：12-14，23.

［5］ Hadj-Taieb Noomen，Ayadi Malika，Trigui Samah，et al.Hyperproduction of pectinase activities by a fully constitutive mutant(CY1)of Penicillium occitanis［J］.Enzyme and Microbial Technology，2002，30(5)：662-666.

［6］ 諸葛健，王正祥.工業微生物實驗技術手冊［M］.北京：中國輕工業出版社，1994.

［7］ 章名春.工業微生物誘變育種［M］.北京：科學出版社，1984.

［8］ 張玉墀.果膠酶產生菌的選育［J］.食品科學，1987，(2)：14-18.

［9］ 陳峰，俞吉安，張承康，等.果膠分解菌的簡便篩選方法［J］.微生物學雜志，1999，19(4)：63.

［10］ 崔莉，張陳虎，錢國坻，等.果膠酶酶解產物DNS比色法測定條件的研究［J］.印染，2002，28(12)：32-35.

［11］ 王弋博，劉向陽，李三相，等.用紫外誘變及紫外+硫酸二乙酯復合誘變方法選育高產異淀粉酶菌株［J］.青海大學學報，2003，21(4)：7-10.