不同底物對海洋混合菌群產氫的影響

劉洪艷

(天津科技大學海洋科學與工程學院天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津300457)

氫氣被認為是未來最理想的清潔能源，其以燃燒值高、清潔無污染、適應范圍廣等優點越來越受到人們青睞［1］。生物制氫包括微藻制氫、光合細菌制氫和微生物暗發酵制氫3種方式。微生物暗發酵制氫可以分為純菌種或混合菌群2種方式，混合菌群可利用生物廢棄物制氫，相比具有更多優勢［2-3］。影響混合菌群產氫效率因素主要有底物、氫氣分壓、耗氫菌對氫氣的利用和培養液pH值［4-5］。目前用于產氫的底物主要包括葡萄糖、蔗糖、淀粉和纖維素等碳水化合物。底物選擇主要標準：可用性、成本、碳水化合物含量和生物降解性［6］。變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)根據不同微生物的16S rRNA基因序列中可變區堿基順序的差異，將來自不同微生物的相同長度擴增片段進行分離，是目前研究微生物遺傳多樣性最有力的分子生物學技術［7］。目前利用有機廢水進行微生物制氫技術多集中在淡水系統，在一些沿海城市，由于淡水資源的缺乏，海水的利用率在逐年加大，加之海水養殖產生的廢水(泥)，造成高鹽的海水有機廢水(泥)大量累積。將單純的海洋有機廢水處理結合生物制氫過程，不僅可以達到環保和資源利用的雙重目的，而且使海水生物制氫實用化。混合菌群產氫性質的相關研究是利用海洋有機廢水進行產業化產氫的前提。本實驗利用DGGE分析不同底物培養條件中產氫混合菌群組成，研究底物種類對從海洋環境中富集的混合菌群產氫影響。為混合菌群應用于海洋有機廢水發酵產氫提供相關參數。

1 材料與方法

1.1 產氫混合菌群富集與培養

液體培養基參照Liu等［8］稍有修改，成分如下(g/L)：牛肉膏2，酵母提取物1，NaCl 30，K2HPO41.5，MgCl20.1，FeSO4·7H2O 0.1，L-半胱氨酸0.5，維生素液10 mL/L(VB120.01，VC 0.025，VB20.025，檸檬酸0.02，VB60.05，葉酸0.01)，微量元素液10 mL/L(MnSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.05，H3BO30.01，CaCl2·2H2O 0.01，Na2MoO40.01，CoCl2·6H2O 0.2)，刃天青(0.1%)1 mL，pH 7.2。

污泥取自天津海水浴場潮間帶。取10 g污泥，加蒸餾水按1∶1稀釋，于121℃，10 min熱休克處理，室溫冷卻。在上述液體培養中分別添加葡萄糖，蔗糖，乳糖，淀粉和蛋白胨(20 g/L)，構成含有不同底物的培養基。熱處理污泥等量接種到葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉和蛋白胨培養基中，充氮氣1 min，120 r/min，37℃培養24 h。按1∶100接種連續培養3次，富集厭氧混合菌群進行發酵產氣，連續厭氧發酵48 h。用5 mL注射器定時取樣，測定pH值、OD值和氧化還原電位(ORP)。pH值和氧化還原電位采用METTLER TOLEDO酸度計測定，采用島津分光光度計測定OD值。

1.2 方法

1.2.1 氫氣含量測定氣體的收集采用排水法。利用氣相色譜儀(Agilent，型號6820)測定發酵氣體中氫氣的含量。氮氣做載氣，流量為25 mL/min，色譜柱填料為5 A分子篩(60/80目)，柱長2 m，檢測器為熱導檢測器(TCD)。柱溫、進樣器溫度和檢測器溫度分別為40、200、200℃。

1.2.2 16SrRNA基因PCR擴增以細菌16S rRNA基因V3區通用引物擴增，引物［9］GC-357F：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和517R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反應體系50 μL反應體系包括以下成分：buffer 5 μL(10×)，引物GC-357F和517R各1 μL(10 μmol/L)，dNTP 1 μL(10 mmol/L)，TaqDNA聚合酶1 μL(5 U/L);模板1 μL;超純水40 μL。反應程序為94℃4 min;94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30個循環;72℃，10 min。擴增產物經瓊脂糖電泳檢測，條帶單一即可以用做DGGE分離。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對PCR產物進行分離。制備8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30%到60%，在150 V的電壓下，60℃電泳3 h，采用AgNO3法染色。切取目的條帶，利用聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒(BIOFLUX)提取與純化DNA，并將回收的DNA作為模板重新擴增進行測序，序列在NCBI數據庫中進行BLAST，測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 不同底物培養條件下混合菌群pH和OD600

不同底物培養條件下混合菌群發酵液終OD600及pH見圖1。連續發酵48 h時，測定發酵液OD600值和pH。OD600間接表示混合菌群的生長狀態，混合菌群以蔗糖為底物時，OD600值最高。混合菌群以葡萄糖和蔗糖為底物時，發酵液pH相比起始值(7.2)下降明顯，發酵液pH的下降是由于細菌厭氧發酵產氫過程中，有機酸是伴隨氫氣的生成，由于有機酸的積累導致發酵液pH值降低［10］。以蛋白胨為底物的發酵過程中，即代表底物沒有碳水化合物只有蛋白質時，發酵液的pH基本沒有變化，這表明該組混合菌不能利用蛋白質為能量來源進行發酵。從產氣量看，蛋白胨也基本無氣體產生，故蛋白胨不適合作發酵底物。

圖1 不同底物對混合菌群終pH和OD600的影響Fig.1 The effect of various substrates on finial pH and OD600of mixed culture

2.2 不同底物培養條件下混合菌群的產氫量

高效產氫菌群的顯著特征之一是利用多種底物種類進行產氫［11-12］。設置4個底物來代表碳水化合物，包括單糖(葡萄糖)、雙糖(乳糖和蔗糖)、多糖(淀粉)，蛋白胨代表底物是蛋白質。圖2表示混合菌群在不同底物培養條件下的產氫量。以葡萄糖、蔗糖、淀粉和乳糖為底物時，混合菌群的產氫量依次為(530±20)、(787±24)、(455±35)和(46±5)mL/L(mean±S.E.)。以蛋白胨為底物時，混合菌群基本不產氫，這與文獻［4，13］的報道類似，原因可能是蛋白質在轉化為氨基酸的過程不能夠產氫。

蔗糖為底物時，混合菌群產氫量最高，分析菌群發酵過程中pH、ORP和OD600的變化見圖3。發酵液pH在4～14 h之間從6.95急劇下降到4.51，隨后仍表現出略微的下降，至38 h時pH基本維持在4.0不變。氧化還原電位(ORP)是表示產氫能力的一個間接指標，在發酵過程中，較高的產氫效率發生在發酵液處于較低的ORP值時，可以作為產氫效率的實時調控指標［14］。在實驗中，ORP由初始的20 mV急劇下降為-54 mV，隨后雖然有所上升，但在38 h之內一直維持在0 mV以下，44 h后基本維持20 mV不變。由OD600可以看出，在4～38 h之間菌群出現指數增長的趨勢，38 h之后菌群不再增長，維持不變，隨后略微下降。產氣過程主要集中在4～38 h之內，即發酵產氫在38 h時停止。

圖2 不同底物對混合菌產氫量的影響Fig.2 Effect of various substrates on hydrogen production of mixed culture

圖3 蔗糖為底物培養條件下混合菌pH、ORP和OD600的變化Fig.3 The variation of OD600，pH，ORP of mixed culture using sucrose as substrate

2.3 不同底物培養下混合菌群16S rRNA的PCR擴增

采用16S rRNA基因V3高變異區通用引物357F和517R對基因組DNA進行擴增，在引物357F的5'端添加GC夾以提高擴增片斷的分離效果。不同底物發酵菌16S rRNA基因PCR擴增結果見圖4。瓊脂糖凝膠電泳顯示片斷大小約200 bp左右，與預期目標一致，PCR樣品可以直接用于DGGE實驗。

圖4 不同底物培養下的混合菌群16S rRNA的PCR擴增產物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene of mixed culture under different substrate conditions

2.4 不同底物培養下的混合菌群16S rRNA的DGGE分析

不同底物培養下，混合菌群組成見圖5。將圖中標記的條帶進行膠回收，并以537F和517R為引物進行PCR擴增，擴增產物測序結果利用BLAST軟件進行比對，確定條帶DNA片段代表的微生物種屬。DGGE電泳中條帶位置相同，表明條帶所代表的微生物菌屬是相同的，條帶的強弱不同則表明菌屬的數量存在差異。

圖5 混合菌群DGGE圖譜Fig.5 DGGE profile of 16S rRNA gene of mixed culture

比對結果見表1，在葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉為底物培養時，混合菌群的優勢菌條帶位置基本相同，表明混合菌群組成基本相同，梭菌屬(Clostridium sp.)是發酵液中占優勢菌屬。以淀粉為底物時，優勢條帶位置與葡萄糖、蔗糖、乳糖基本相同，但條帶3所代表菌屬在以淀粉為底物時，其染色密度要明顯高于其他底物培養，這表明條帶3所代表Bacillus sp.在以淀粉為底物時得到大量富集，Bacillus sp.是一類兼性厭氧菌，對培養條件要求比較寬松，這將促進該混合菌群應用于含淀粉有機廢水中。混合菌群以蛋白胨為底物時，不能有效形成優勢菌，細菌生長受到抑制。

表1 優勢菌16S rRNA基因DGGE圖譜條帶的比對結果Table 1 Affiliation of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)fragments determined by 16S rRNA sequence of mixed culture

3 討論

葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉為底物時，混合菌群利用蔗糖產氫量最高;在沒有碳水化合物時，混合菌群不能夠利用蛋白胨產氫。

葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉為底物時，混合菌群16S rRNA基因DGGE電泳分離得到的優勢條帶位置基本相同，混合菌群中優勢菌組成是相同的，豐度最高條帶所代表菌株的測序結果是Clostridium sp.。為獲得高效產氫菌Clostridium sp.占絕對優勢的混合產氫菌群，熱休克預處理方法能夠起到比較理想效果。

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