長效和短效NO發(fā)生劑體內(nèi)干預(yù)瘧原蟲紅內(nèi)期重要侵襲分子轉(zhuǎn)錄水平的觀察

鄭麗，李銀燕，劉軍，潘艷艷，李瑩，延娟，曹雅明*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧沈陽110001)

瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播的嚴重威脅人類健康的寄生原蟲感染性疾病。瘧原蟲裂殖子快速識別并入侵適宜其發(fā)育的宿主紅細胞的侵襲過程是一個復(fù)雜的多蛋白參與并有序協(xié)調(diào)合作的過程［1］。裂殖子借助其表面蛋白家族(MSPs)成員，頂端復(fù)合體表面抗原-1(AMA-1)以及棒狀體內(nèi)含有的多種蛋白(RhopH complex)完成瘧原蟲黏附、侵入紅細胞這一復(fù)雜過程［2-4］。由于紅內(nèi)期各蛋白在侵襲過程中暴露于宿主免疫系統(tǒng)，所以它們是發(fā)病阻斷疫苗理想的候選抗原，也因此成為近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點課題。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為非特異性免疫效應(yīng)分子，在抗多種病原生物感染的過程中發(fā)揮著重要的防御作用［5］。前期的研究結(jié)果顯示NO是控制和消除紅內(nèi)期蟲體血癥的重要免疫效應(yīng)分子［6-7］。NO通過細胞毒效應(yīng)可明顯抑制感染人類和嚙齒類的紅內(nèi)期原蟲的生長及發(fā)育［8-9］。同時，NO還可通過抑制感染惡性瘧原蟲的紅細胞對微血管內(nèi)皮細胞的黏附保護易感宿主［10］。由此推測，NO可能通過某種機制改變瘧原蟲與宿主紅細胞間的相互作用有關(guān)，從而減弱瘧原蟲裂殖子的致病力，然而NO這種影響侵襲力的分子機制目前尚不清楚。本研究通過NO長效和短效發(fā)生劑體內(nèi)對致死型約氏瘧原蟲進行處理，探討NO對介導(dǎo)裂殖子黏附、侵入紅細胞的關(guān)鍵分子MSP-1、AMA-1和RhopH complex轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期明確宿主與寄生蟲相互作用的本質(zhì)特征和宿主抗瘧原蟲保護性免疫的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6～8周齡雌性BALB/c小鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，許可證編號：SCXK6京2004-0001)。

1.1.2 主要試劑NOC5(347-06881，和光純藥工業(yè)株式會社，半衰期25 min);NOC18(344-06911，和光純藥工業(yè)株式會社，半衰期18 h);TRIzol?Reagent：invitrogen產(chǎn)品;SYBR?Prime-ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.1.3 主要儀器PCR儀(pTC-200，peltierThermalCyeler);ABI PRISM 7900 HT(USA)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物感染與NO發(fā)生劑體內(nèi)處理30只雌性，6～8周齡BALB/c小鼠，每只經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細胞(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈)，小鼠隨機分為3組，第1組單純感染對照組(10只);第2組NOC18 25 mmol/L處理組(10只);第3組NOC5 25 mmol/L處理組(10只)。感染后第2天，第2組小鼠尾靜脈注射25 mmol/L NOC18，每只小鼠100 μL，每隔20 h注射1次，連續(xù)注射3次。感染后第6天第3組小鼠腹腔注射25 mmol/L NOC5，每只小鼠100 μL，30 min后處死小鼠。感染不同時間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計數(shù)紅細胞感染率。

1.2.2 成熟裂殖體純化心臟取血采集P.y17XL感染的BALB/c小鼠感染血液(感染率達60%～80%)，與等倍PBS混合后通過滅菌纖維素CF11除去白細胞，以50%Percoll(體積比)分離、收集。細胞計數(shù)板計數(shù)裂殖體數(shù)量。取1×108個裂殖體儲存于1 mL Trizol中，-20℃保存，供總RNA提取。

1.2.3 Real-time PCR檢測NO發(fā)生劑體內(nèi)處理MSP-1、AMA-1和RhopH complex轉(zhuǎn)錄水平①PCR引物：利用引物設(shè)計軟件Primer5設(shè)計約氏瘧原蟲β-actin、MSP-1、AMA-1和RhopH complex特異性引物(表1);②實時定量PCR檢測：采用TRIZOL一步法提取瘧原蟲總RNA，并經(jīng)紫外分光光度儀檢測純度，RNA A260/A280比值在1.8～2.0之間;按照TaKaRa SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒步驟以總RNA為模板進行cDNA合成，反應(yīng)體積20 μL(5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Total RNA 1 μg，反應(yīng)體積用RNA free H2O補至20 μL);反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s，Real time PCR擴增反應(yīng)采用SYBR Green I嵌合熒光法反應(yīng)，反應(yīng)體積20 μL(SYBRPremixExTapTM(2×)10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L)0.8 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，模板(cDNA溶液)0.2 μL，ddH2O 7.8 μL);反應(yīng)條件：95℃30 s預(yù)變性，95℃5 s，60℃30 s反應(yīng)40個循環(huán)。并檢測融解曲線;③實驗結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，以β-actin值為內(nèi)參，通過2-△△CT計算表達倍數(shù)。

表1 用于實時定量PCR擴增的引物序列Table 1 The primer sequences for real-time PCR

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件，單因素方差分析比較各組均值的顯著性差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 長效和短效NO發(fā)生劑處理后約氏瘧原蟲AMA-1轉(zhuǎn)錄水平的變化

圖1 NOC18和NOC5處理后瘧原蟲AMA-1轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.1 The transcription levels of AMA-1 after NOC18 or NOC5 treatment

如圖1所示，P.y 7XL感染BALB/c小鼠過程中，瘧原蟲頂端膜分子抗原AMA-1轉(zhuǎn)錄水平存在差異。與NO未處理組相比長效NO發(fā)生劑NOC18處理后未見AMA-1轉(zhuǎn)錄水平受到影響，而短效NO發(fā)生劑NOC5處理后可見AMA-1分子的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 長效和短效NO發(fā)生劑處理后約氏瘧原蟲MSP-1轉(zhuǎn)錄水平的變化

通過NO發(fā)生劑體內(nèi)處理P.y17XL感染小鼠可見MSP1轉(zhuǎn)錄水平受到一定程度的影響。如圖2所示，與NO未處理組相比長效NO發(fā)生劑NOC18處理后可見MSP-1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而短效NO發(fā)生劑NOC5處理后可見MSP-1分子的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，兩者均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 NOC18和NOC5處理后瘧原蟲MSP-1轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.2 The transcription levels of MSP-1 after NOC18 or NOC5 treatment

2.3 長效和短效NO發(fā)生劑處理后約氏瘧原蟲RhopH complex轉(zhuǎn)錄水平的變化

圖3 NOC18和NOC5處理后瘧原蟲RhopH complex轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.3 The transcription levels of RhopH complex after NOC18 or NOC5 treatment

通過長效或短效NO發(fā)生劑體內(nèi)處理P.y17XL感染小鼠可見RhopH complex轉(zhuǎn)錄水平受到一定程度的影響。如圖3所示，與NO未處理組相比長效NO發(fā)生劑NOC18處理后未見RhopH complex轉(zhuǎn)錄水平受影響，而短效NO發(fā)生劑NOC5處理后可見RhopH complex分子的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

在瘧原蟲的各生活周期中，裂殖子期原蟲破裂宿主紅細胞和重新入侵的周期性過程是宿主寒戰(zhàn)、發(fā)熱和貧血等一系列瘧原蟲感染后病理癥狀產(chǎn)生的基礎(chǔ)［11］。紅內(nèi)期循環(huán)啟動的關(guān)鍵點是裂殖子快速識別并入侵適宜其發(fā)育的宿主紅細胞。與大多數(shù)具有頂端復(fù)合體結(jié)構(gòu)的原蟲(如弓形蟲)相似，形成于紅內(nèi)期晚期的頂端結(jié)構(gòu)可通過釋放其內(nèi)部特異性分泌器官—棒狀體、微線體和致密顆粒幫助裂殖子侵襲宿主紅細胞。其中，棒狀體和微線體在裂殖子侵襲過程中分泌大量侵襲相關(guān)蛋白。這些蛋白或釋放于裂殖子表面，或進入宿主紅細胞內(nèi)部，在這些部位，它們幫助裂殖子在極短的時間內(nèi)(＜60 s)完成對宿主細胞的識別，配-受體連接，入侵激活以及侵入后納蟲泡的形成。由于頂端復(fù)合體內(nèi)的各蛋白在侵襲過程中暴露于宿主免疫系統(tǒng)，所以它們是發(fā)病阻斷疫苗理想的候選抗原。也因此成為近年來國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點課題［12-13］。

MSP-1、AMA-1和RhopH complex是瘧原蟲紅內(nèi)期表達的關(guān)鍵蛋白，在瘧原蟲侵入過程中發(fā)揮重要作用。通過MSP-1、AMA-1和RhopH complex為抗原誘導(dǎo)的抗體對瘧原蟲入侵紅細胞均具有一定抑制作用［14-17］。前期的研究結(jié)果顯示，應(yīng)用NO發(fā)生劑(NOC5或NOC18)體外處理瘧原蟲成熟裂殖體后，裂殖子對紅細胞的侵襲能力顯著減弱或喪失。而且，NO對裂殖子的抑制效應(yīng)呈明顯的時間和劑量依賴性［18］。盡管NO作為非特異性免疫效應(yīng)分子，在抗腫瘤發(fā)生、誘導(dǎo)瘤細胞凋亡和抗菌、抗病毒及胞內(nèi)寄生性原蟲等多種病原生物感染過程中，發(fā)揮著重要的免疫介導(dǎo)和防御作用，但是血紅蛋白對NO的耗竭具有極強的作用，而頂端復(fù)合體內(nèi)的各蛋白在侵襲過程中暴露于宿主免疫系統(tǒng)下，因此本研究通過實時定量PCR檢測了侵襲過程中重要的瘧原蟲侵襲相關(guān)分子MSP-1、AMA-1以及RhopH complex水平。從轉(zhuǎn)錄水平看，短效NO發(fā)生劑NOC5體內(nèi)處理P.y17XL感染的BALB/c小鼠，對瘧原蟲MSP-1、AMA-1以及RhopH complex分子具有明顯抑制作用，而長效NO發(fā)生劑NOC18則未見這一現(xiàn)象。這一結(jié)果推測在DBA/2和BALB/c小鼠感染P.y17XL的鼠瘧自然模型里DBA/2在感染早期存在NO短時間的高水平釋放，因而對瘧原血癥有一定控制作用。因此本研究結(jié)果提示，宿主體內(nèi)存在的NO短時間、高水平的釋放對宿主控制瘧原血癥具有一定的作用。

綜上所述，NO對瘧原蟲侵襲相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平有一定影響，通過高劑量、短期的NO干預(yù)可影響決定瘧原蟲侵入的關(guān)鍵蛋白MSP-1、AMA-1以及RhopH complex的轉(zhuǎn)錄水平，進而可能影響瘧原蟲的侵入過程。

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